足撞擊對大鼠腦及不同腦區(qū)il-1含量的影響

足撞擊對大鼠腦及不同腦區(qū)il-1含量的影響

中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫球蛋白之間有著密切的功能關系（通過激素、神經(jīng)末梢和神經(jīng)流質(zhì)指南）。目前有關細胞因子在神經(jīng)和免疫兩大系統(tǒng)之間的作用已被證明,并引起許多學者的關注。中樞IL-1β作為一種中樞應激介導因子,不僅參與應激引發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌反應,也參與某些應激反應的行為調(diào)控及不同類型應激引發(fā)的心血管反應的中樞調(diào)節(jié)。中樞引入IL-1β也能誘發(fā)與應激極其類似的反應,如血壓升高、下丘腦-垂體-腎上腺軸激活、體溫上升、痛閾上升等。以往Maier等研究報道在切除腎上腺的大鼠電擊其尾部2h后,出現(xiàn)下丘腦等IL-1β蛋白含量的增加,但腎上腺完整的大鼠卻未見明顯的變化。在束縛、腦缺血及電擊鼠尾等應激刺激的作用下,也可引起中樞IL-1β含量及IL-1βmRNA的表達增加。近幾年,Zou等應用電擊大鼠足底結(jié)合噪音刺激的方法,可引起大鼠血壓升高,結(jié)合IL-1β在中樞能引起血壓升高的結(jié)果設想電擊足底應激反應時,如果能引起IL-1β含量增加,可能是電擊大鼠足底引起血壓升高的原因之一,這方面的研究未見報道。鑒于機體對刺激的反應受刺激的性質(zhì)、部位、動物的種屬等多種因素的影響。因此,本實驗采用電擊大鼠后足的方法,測定其對大鼠腦脊液以及室旁核、杏仁核、海馬、延髓、小腦內(nèi)IL-1β含量的影響,以鑒證IL-1β在應激誘發(fā)高血壓形成中的可能作用及涉及的中樞部位。材料和方法1抗氧化應激活劑part白細胞介素-lβ(recombinantratIL-1β,R&DSystems,Inc);白細胞介素-1β抗體(monoclonalantiratIL-1βantibody,R&DSystems,Inc);生物素化的白細胞介素-1β抗體(biotinylatedanti-ratIL-1βantibody,R&DSystems,Inc);辣根過氧化物酶(streptavidin-HRP,R&DSystems,Inc);底物反應盒(substratereagentpack,R&DSystems,Inc);牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA,Sigma);蛋白酶抑制劑(aprotinin,boehringer);苯甲基磺酰氟(PMSF,Boehringer);NP-40(nonidenP40substitute,Boehringer);考馬斯亮藍G250(coomassiebrilliantblueG250,Fluka);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA);吐溫20(Tween20)等。2烏拉坦腦區(qū)手術選用體重230-280g的雄性Wistar大鼠,用20%烏拉坦(0.6mL/100gBW,ip)麻醉,做第四腦室插管抽吸腦脊液、斷頭分離不同腦區(qū)手術。2.1樣品的收集和處理①第四腦室插管抽吸腦脊液:剪開頭皮暴露枕骨大孔,用6號針頭刺破此處的硬腦膜見腦脊液流出后,從此孔插入PE-10管約3.0mm,再通過PE-20管連至蠕動泵上,以200μL/30min的速度連續(xù)抽吸腦脊液60min,每30min收集1次樣品。為防止腦脊液的匱乏,將側(cè)腦室經(jīng)側(cè)腦室插管并與裝有約3.0mL人工腦脊液的試管相連,以補充腦脊液用。②側(cè)腦室插管:剪開頭皮暴露顱骨,將直徑為0.8mm的腦室插管插入腦室后,再用牙托粉及牙托水固定。腦室插管的尖端位置是前囟1.0mm,正中線外側(cè)1.5mm,顱骨表面下5.0mm。實驗完畢后通過斷頭檢查側(cè)腦室插管的位置。③斷頭分離不同腦區(qū):實驗完畢后斷頭,剪開顱骨,于冰上取出腦組織并依照下圖分離室旁核、杏仁核、海馬、延髓、小腦等(圖1)并于-80℃保存,在測IL-1β含量時,先將腦組織勻漿再按重量比1:5稀釋,在4℃情況下放置1h,經(jīng)10000r/min離心后取上清備用。2.2單次最佳樣品的收集將所有實驗動物分成對照組與足電擊組。對照組:僅做側(cè)腦室插管和第四腦室抽吸腦脊液的手術,以200μL/30min的速度連續(xù)抽吸腦脊液,每30min收集1次樣品,共收集2次,60min。足電擊組:用裸露的銅絲縛于大鼠雙后足踝部,再用DDC-2A型多用電生理刺激器電刺激(14V,50Hz,1s)大鼠雙后足部5min、10min、15min和20min。樣品收集開始時,完成電擊后,分別以每25min、20min、15min和10min收集0-30min的腦脊液,然后繼續(xù)收集30-60min的腦脊液。實驗完畢后,斷頭,取出腦組織,依次分離下丘腦、杏仁核、海馬、延髓和小腦,并放入-80℃保存。3標準品的測定本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定IL-1β濃度。用抗大鼠IL-1β單抗包被于酶標板上,100μL標準品或樣品(腦脊液、腦區(qū)的提取物)用于測定。標準品或樣品中的IL-1β與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗大鼠IL-1β,形成免疫復合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的streptavidin與生物素結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺,出現(xiàn)黃色,加終止液硫酸,顏色變深,在492nm處測A值,可通過繪制標準曲線求出IL-1β的濃度。4統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示,并用ANO-VA及post-hocFisherLSD檢驗各組間的差異顯著性。結(jié)果1各組大鼠體內(nèi)瞳內(nèi)西語il-1水平在足電擊前,各組大鼠腦脊液IL-1β的含量無明顯差異,其IL-1β的含量在(4.795±0.648)mg/L-(6.876±2.184)mg/L。用14V、50Hz連續(xù)電擊大鼠后足部5min時,其腦脊液IL-1β的含量在30min內(nèi)明顯高于對照組;20min電擊大鼠后足部時,其腦脊液IL-1β的含量在30-60min內(nèi)也明顯增高(圖2)。2不同劑量足電化學大鼠杏仁核及室旁核il-1、延髓、海馬內(nèi)il-1含量比較用14V、50Hz電擊大鼠后足(5min、10min、15min及20min)時,除20min足電擊大鼠引起其杏仁核及室旁核IL-1β含量明顯高于對照組外,延髓、小腦、海馬內(nèi)IL-1β含量均無明顯變化(圖3)。不同模型條件下足放電大鼠il-1的釋放白細胞介素-1β(IL-1β)為重要的多效性細胞因子,它既可由外周許多細胞(淋巴細胞等)產(chǎn)生;又可由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元及內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生。它不僅在正常生理條件下起著重要作用,如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控、大腦學習和記憶等功能,而且還參與了多種病理生理過程。目前,中樞IL-1β作為一種中樞應激介導因子,在應激性高血壓發(fā)病機制中的作用逐漸受到關注。以往研究報道在束縛、腦缺血等應激刺激的作用下,可引起中樞IL-1β含量及IL-1βmRNA的表達增加,且電擊大鼠足底結(jié)合噪音刺激的方法,可引起大鼠血壓升高,如果電擊足底應激反應時,能引起IL-1β含量增加,推測中樞IL-1β可能參與電擊大鼠足底時的升壓反應。本實驗主要應用電擊大鼠后足的方法,觀察對中樞內(nèi)IL-1β含量的影響,結(jié)果顯示,應激刺激5min后,收集30min內(nèi)腦脊液,IL-1β的含量明顯增加,反應出現(xiàn)很快,不太可能來自新合成的IL-1β;雖然文獻報道中樞IL-1β也可由外周許多細胞(淋巴細胞等)產(chǎn)生,但由于IL-1β為一分子量17kD的蛋白質(zhì),在生理情況下,它的血漿濃度低且在短時間內(nèi)很難通過血腦屏障,因此在5min足電擊大鼠引起腦脊液IL-1β含量的增加,提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放已合成的IL-1β。而足電擊20min的大鼠其腦脊液IL-1β的含量30-60min增加,可能還有外周的IL-1β以主動轉(zhuǎn)運的方式通過腦內(nèi)血腦屏障較弱的一些區(qū)域進入中樞(如終紋血管器、最后區(qū)、脈絡叢及正中隆起等處)。20min足電擊大鼠還可引起杏仁核及室旁核內(nèi)的IL-1β含量增高。說明足電擊大鼠時,既可引起中樞IL-1β的釋放,也可能引起中樞IL-1β的合成。因為在應激刺激后20min,可引起大鼠室旁核及杏仁核IL-1β蛋白含量增高,這與應激性刺激可引起腦干、下丘腦等心血管調(diào)節(jié)區(qū)IL-1βmRNA表達增加以及IL-1β含量升高,間隙性電擊大鼠