粵西漢族人pai-1基因啟動(dòng)子區(qū)單倍型與缺血性腦卒中的關(guān)系

粵西漢族人pai-1基因啟動(dòng)子區(qū)單倍型與缺血性腦卒中的關(guān)系

減少纖溶功能是多種血閉性疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一。纖溶酶原激生劑-1的主要生理功能是抑制組織纖溶酶激生物和尿激酶激生物的活性。這是調(diào)整纖溶系統(tǒng)活性平衡的重要組成部分，纖溶活性平衡是防止血栓形成的重要保護(hù)機(jī)制。目前研究發(fā)現(xiàn),血漿PAI-1水平受多種環(huán)境因素及遺傳因素影響,其中PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)的某些功能性單核苷酸多態(tài)性如4G/5G、-844G/A與血漿PAI-1水平的增高有關(guān)。但PAI-1基因單核甘酸多態(tài)性與缺血性心腦血管疾病在不同地區(qū),人群及種族的研究結(jié)果不一致,一直存在爭(zhēng)議。本研究初步探討了位于PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的4G/5G、-844G/A單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中(IS)發(fā)病的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)告如下。1pcr和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法1.1一般資料所有對(duì)象來(lái)自廣東粵西地區(qū)漢族人。其中病例組系2002年8月~2003年8月本院神經(jīng)內(nèi)科住院的72h發(fā)病的初治缺血性腦卒中患者共130例,為病例組,男78例,女52例,平均年齡(64.81±8.87)歲。所有病例均符合WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組:隨機(jī)選擇同期健康體檢者,均排除心、腦血管疾病,無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂及遺傳疾病史,共112例,對(duì)照組男67例,女45例,平均年齡(63.05±7.06)歲。1.2方法缺血性腦卒中患者(發(fā)病后,治療前)及正常對(duì)照組個(gè)體于清晨空腹、臥位采集肘靜脈血5ml,以3.8%枸櫞酸鈉1:9抗凝,室溫下離心分離血漿置于-80℃保存,酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)血漿PAI-1水平。1.3采用鹽抽提法,稍作改良以從白細(xì)胞中抽提基因組DNA。1.4PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物序列,序列及酶解片段見(jiàn)表1(引物由上海工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。擴(kuò)增體系如下:總反應(yīng)體積25μl,含待測(cè)基因組DNA0.2μg,dNTP0.2mmol/L,MgCl21.5~2.5mmol/L,10×buffer2.5μl,Taq酶0.75U,上下游引物各42μmol/L,擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性7min,94℃變性55s,退火條件見(jiàn)表1,72℃50s,循環(huán)32次。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有資料輸入MicrosoftExcel97中建立數(shù)據(jù)庫(kù),并運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。應(yīng)用基因記數(shù)方法計(jì)算出相對(duì)等位基因頻率。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,用t檢驗(yàn),基因型Hardy-Weinberg平衡吻合度采用χ2檢驗(yàn)。采用EH+軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析及單倍型分析。多態(tài)性位點(diǎn)與缺血性腦卒中患病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性用比值比(oddsratios,OR)及其95%可信區(qū)間(confidenceintervals,CI)表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布病例組及對(duì)照組中4G/5G、-844G/A多態(tài)性位點(diǎn)基因型分布均符合Hard-Weinberg平衡,均具有群體代表性。病例組和對(duì)照組之間兩個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。2.3單倍型分析PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性所構(gòu)建的單倍型有4種,見(jiàn)表4。單倍型分析結(jié)果顯示4G-A-844在病例組的頻率較高,與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而5G-G-844在對(duì)照組的分布頻率高于病例組(P<0.01)。3四、4-1單晶甘酸多態(tài)性與is關(guān)聯(lián)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PAI-1基因4G/5G多態(tài)性位點(diǎn)的5G等位基因與4G等位基因相比,在PAI-1啟動(dòng)子區(qū)插入了1個(gè)堿基而創(chuàng)造了一個(gè)核蛋白(因子B)的結(jié)合位點(diǎn),此蛋白可行使轉(zhuǎn)錄抑制作用。而4G位點(diǎn)只結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,具有較高的PAI-1基因轉(zhuǎn)錄速率,且4G/4G純合子型者的細(xì)胞有較高的PAI-1分泌功能和血漿較高PAI-1水平。PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)的另一個(gè)單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)-844G/A位于潛在的Ets蛋白DNA的限制序列,能影響PAI-1基因的轉(zhuǎn)錄。提示血漿PAI-1水平和PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)4G/5G、-844G/A等功能性位點(diǎn)之間有直接關(guān)系。高水平的PAI-1可以抑制t-PA,導(dǎo)致纖溶活性降低,參與血栓的形成;同時(shí)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化及動(dòng)脈壁增厚,故易于導(dǎo)致缺血性腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生。近年來(lái)的病例對(duì)照研究結(jié)果表明PAI-1基因4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)與IS的發(fā)病密切相關(guān),是IS的重要危險(xiǎn)因子之一,可增加IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。然而,亦有部分研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)PAI-1基因多態(tài)性與IS關(guān)聯(lián)。本文研究結(jié)果顯示,在IS組中,以4G/5G位點(diǎn)的4G4G基因型個(gè)體為多,其分布頻率最高(0.469),4G等位基因的頻率為0.6577。而正常對(duì)照組4G/5G位點(diǎn)4G4G基因型相對(duì)較低(0.232),4G、5G等位基因的頻率分別為0.5117、0.4883,與病例組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)照組-844G/A位點(diǎn)的野生型GG、雜合子GA、純合子AA的頻率分別為0.420、0.464、0.116。與對(duì)照組比較,IS組GG基因型分布頻率明顯降低(0.238),A-844等位基因頻率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述研究結(jié)果說(shuō)明4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性與IS關(guān)聯(lián),4G/5G的4G、A-844等位基因的攜帶者比非攜帶者患IS的相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)分別大1.789倍、1.681倍。本文的研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)ShaoyongSu等人報(bào)道相似,通過(guò)一組病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn),在非吸煙人群中,4G/5G位點(diǎn)的4G等位基因、-844G/A位點(diǎn)的A等位基因與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。4G/5G和-844G/A單核甘酸多態(tài)性毗鄰,均位于PAI-I基因啟動(dòng)子區(qū)域。通常認(rèn)為相距較近的位點(diǎn)連鎖不平衡程度較緊密。Kathiresan等的研究認(rèn)為由于4G/5G和-844G/A單核甘酸多態(tài)性之間存在緊密連鎖不平衡關(guān)系,故不易判斷哪個(gè)位點(diǎn)通過(guò)影響血漿PAI-1水平而導(dǎo)致缺血性心腦血管疾病的發(fā)生。因此,為了進(jìn)一步了解兩個(gè)位點(diǎn)與IS的關(guān)系,作者構(gòu)建了兩個(gè)位點(diǎn)的單倍型,發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組之間4G-A-844和5G-G-844單倍型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組中5G-G-844的頻率明顯高于病例組(P<0.01),表明該單倍型與降低IS的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián),可能是保護(hù)性單倍型,而病例組中4G-A-844的頻率高于對(duì)照組(P<0.01),提示該單倍型與IS的易感性關(guān)聯(lián),攜帶單倍型4G-A-844可能會(huì)增加患IS的風(fēng)險(xiǎn)?？傊?本研究中分析了廣東粵西地區(qū)PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性在IS患者中的分布頻率差異,并研究與疾病發(fā)生危險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果表明4G/5G、-844G/A單核甘酸多態(tài)性與IS密切關(guān)聯(lián),4G/5G的4G、A-844等位基因可以增加患IS的危險(xiǎn)性,單倍型4G-A-844可能為IS的遺傳易感因素。上述研究結(jié)果將為缺血性腦卒中的一、二級(jí)預(yù)防提供一定的線索及理論依據(jù)。1.5酶切PCR產(chǎn)物及電泳分析取-844G/A位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物15μl,加入限制內(nèi)切酶XhoI5U及相應(yīng)酶切緩沖液37℃水浴過(guò)夜。將4G/5G位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及-844G/A位點(diǎn)酶切產(chǎn)物在3%