去海馬傳入對免疫應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核和視上核催產(chǎn)素能神經(jīng)元功能活動的影響

去海馬傳入對免疫應(yīng)激大鼠下丘腦室旁核和視上核催產(chǎn)素能神經(jīng)元功能活動的影響

許多研究表明，網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在接受抗原刺激后迅速恢復(fù)，并將免疫信息傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，這不僅影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動，而且受影響。前人的研究發(fā)現(xiàn),海馬結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)機體免疫活動的功能。海馬調(diào)控免疫系統(tǒng)的傳出途徑一般認為有三條:海馬-下丘腦-垂體-腎上腺軸、自主神經(jīng)系統(tǒng)和體液調(diào)節(jié),其中以海馬-下丘腦-垂體-腎上腺軸調(diào)節(jié)尤為重要。海馬與下丘腦間有纖維聯(lián)系,且通過下丘腦對下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸起抑制作用。研究表明,下丘腦是重要的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)中樞,在免疫應(yīng)答時除促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)能神經(jīng)元及HPA軸被激活外,下丘腦的催產(chǎn)素(OT)能神經(jīng)元也有積極的活動。OT是一種9肽神經(jīng)內(nèi)分泌激素,主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的下丘腦室旁核(PVN)、視上核(SON)中合成。在多種應(yīng)激條件下,中樞OT能神經(jīng)元被激活,釋放大量OT經(jīng)垂體后葉入血,并分泌到腦實質(zhì)的細胞外間隙。大量實驗證據(jù)表明,應(yīng)激后腦內(nèi)OT濃度的升高可參與HPA軸的調(diào)節(jié),而同時外周血中OT濃度升高后可能與胸腺細胞、外周血一些淋巴細胞亞群上的OTR相作用,調(diào)節(jié)這些免疫細胞的功能。有鑒于海馬結(jié)構(gòu)和OT能神經(jīng)元對于免疫都有調(diào)節(jié)作用,且海馬與OT能神經(jīng)元所在的下丘腦間存在纖維聯(lián)系,我們推測海馬對免疫的調(diào)節(jié)功能可能部分是通過OT能神經(jīng)元的“中繼”實現(xiàn)的。為此,我們通過觀察離斷雙側(cè)海馬傘,即去除海馬對下丘腦的大部分支配后,腹腔LPS刺激引起的OT能神經(jīng)元Fos陽性率的變化,以了解海馬調(diào)控免疫反應(yīng)的腦內(nèi)環(huán)路。材料和方法1.藥物、試劑和儀器動物:雄性SD大鼠30只,體重180～200g,為本校動物中心提供的二級清潔動物。試劑:LPS(0127:B8)為Sigma公司產(chǎn)品;兔源性c-Fos抗體購于SantaCruzTech.Inc.公司;小鼠源性O(shè)T抗體為Chemicon公司產(chǎn)品。生物素化的羊抗兔IgG、生物素化的羊抗小鼠IgG以及ABC復(fù)合物購于Sigma公司;山羊血清購于華美公司。儀器:立體定向注射儀SR-6型(NarishigeScientificInstrumentLab.);OlympusBX-60顯微鏡。2.方法2.1動物的人工感染途徑型mds動物在本所動物室適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機分為雙側(cè)海馬傘離斷組(18只)、假手術(shù)組(6只)和正常對照組(6只)。雙側(cè)海馬傘離斷組經(jīng)10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg),固定在腦立體定位儀上,按照大鼠腦定位圖譜,用自制的寬僅1mm的刀片在前囟后1.3mm,距中縫0.5mm,自顱骨表面向下深入5.2mm,橫切距2.5mm,切斷雙側(cè)海馬傘,各點反復(fù)切割20次。假手術(shù)大鼠自顱骨表面向下深入2.6mm,其余數(shù)據(jù)同前,目的是僅切開皮質(zhì)而不傷及海馬傘。正常對照組大鼠未經(jīng)任何處理。所有大鼠飼養(yǎng)24d后,連續(xù)4d進行抓摸訓(xùn)練。將每組動物再隨機等分為A、B兩組:A組動物腹腔注射LPS,劑量為750μg/kg;B組動物給予同體積生理鹽水。3h后,在10g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉下經(jīng)心灌流,先用100ml生理鹽水快速灌注沖洗血液,然后用預(yù)冷的40g/L多聚甲醛固定液400ml灌流。灌注完畢,取腦后固定1h,換200g/L蔗糖,4℃過夜。組織沉底后用冰凍切片機切片,腦片厚50μm,隔五取一,-20℃保存待用。Nissl染色確定橫切位置,定位不準確、雙側(cè)海馬傘未完全離斷的大鼠不列入統(tǒng)計處理。結(jié)果認定,雙側(cè)海馬傘完全離斷+腹腔注射LPS組有4只,雙側(cè)海馬傘完全離斷+腹腔注射生理鹽水組有5只,符合統(tǒng)計學(xué)意義的要求。2.2小鼠美試驗-生產(chǎn)大量發(fā)現(xiàn)藥物,個人成員酶基因型mdi1500將腦片從-20℃冰箱取出,浸入800ml/L甲醇和30ml/L雙氧水封閉30min;再用10g/L牛血清白蛋白、30ml/L羊血清和30ml/LTritonX-100封閉1h。ABC方法如下:兔抗c-Fos抗體(1∶3000)孵育切片,室溫下24h;生物素化的羊抗兔IgG(1∶500)孵育切片,室溫下4h;生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC,1∶500)孵育切片,室溫2h。硫酸鎳胺加強DAB藍色反應(yīng)呈色。當陽性細胞清晰,而背底幾乎無色時,終止反應(yīng)。繼用催產(chǎn)素單抗(1∶5000)孵育切片,室溫下24h;生物素化的羊抗小鼠IgG(1∶500)孵育切片,室溫下4h;生物素-卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC,1∶500)孵育切片,室溫2h。棕色反應(yīng)法成色。各步驟之間均用0.01mol/LPBS漂洗5min×3次。裱片、脫水、透明和封片后,光鏡下觀片并照相。部分切片進行對照實驗,一抗用牛血清白蛋白稀釋液替代,其余步驟同前,結(jié)果陰性。2.3雙標記細胞的百分率在10(目鏡)×20(物鏡)下,每只動物在下丘腦取陽性細胞數(shù)最多的3個平面,對PVN和SON內(nèi)的OT能神經(jīng)元和OT與Fos雙標記的神經(jīng)元進行計數(shù),取平均值,即為該動物此核團的陽性細胞數(shù);用OT與Fos雙標記的神經(jīng)元數(shù)除以O(shè)T能神經(jīng)元數(shù),就得出該動物OT能神經(jīng)元中雙標記細胞的百分率。每組幾個動物分別計算出的百分率取平均值,即為該組動物該核團的雙標記細胞百分率。各組動物的組間差別采用組間t檢驗進行統(tǒng)計分析。對pa外側(cè)大細胞pamp、son腹側(cè)部的刺激免疫組織化學(xué)雙重染色結(jié)果:OT能陽性神經(jīng)元在PVN主要位于其背內(nèi)側(cè)帽(PaDC)、內(nèi)側(cè)大細胞部(PaMM)、腹側(cè)部(PaV)和室周大細胞部(PeM),在Pa內(nèi)側(cè)小細胞部(PaMP)內(nèi)也有散在分布(Fig.3A-D);在SON,OT能神經(jīng)元主要位于其背側(cè)部(Fig.3E-H)。在海馬傘切斷組和假手術(shù)組,經(jīng)LPS刺激的大鼠與給予生理鹽水的大鼠相比,PaMM、PaDC、PaV以及SON背側(cè)部的Fos陽性細胞數(shù)大量增加,可見大量c-Fos/OT雙標記細胞(Fig.3B,D,F,H),而生理鹽水對照組則只有少量雙標記細胞(Fig.3A,C,E,G)。LPS刺激后,除以上核團之外,在Pa外側(cè)大細胞部(PaLM)、PaMP、SON腹側(cè)部也有單純的Fos陽性細胞大量表達,與OT雙標者很少(Fig.3B,D,F,H)。已知PaLM和SON腹側(cè)部是加壓素(AVP)能神經(jīng)元的密集區(qū)域,PaMP主要是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)能神經(jīng)元的所在地。正常對照組LPS注射后的結(jié)果與假手術(shù)組相似(未顯示)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn),接受LPS刺激的動物,其OT能陽性神經(jīng)元的著色(Fig.3B,D,F,H)普遍比生理鹽水對照組的動物(Fig.3A,C,E,G)要深,提示在接受LPS刺激、產(chǎn)生應(yīng)答的過程中,OT能神經(jīng)元合成和分泌OT的功能增強。細胞計數(shù)的結(jié)果顯示,正常對照組、假手術(shù)組、海馬傘切斷組各自接受生理鹽水的動物間OT能神經(jīng)元中雙標記細胞的百分率在PVN分別為:(0.67±0.44)%、(1.00±0.67)%、(2.33±1.11)%;在SON分別為:(6.67±1.56)%、(8.33±2.44)%、(11.67±1.78)%,各組間無明顯差別(P>0.05)。在接受LPS刺激后,三組雙標記細胞的百分率在PVN分別為:(81.00±3.33)%、(78.67±2.44)%、(56.00±2.00)%;在SON分別為:(72.67±5.11)%、(70.67±3.11)%、(75.67±5.11)%,均較相應(yīng)的生理鹽水組顯著升高(P<0.01)。PVN的雙標記細胞百分率在LPS刺激的假手術(shù)組(78.67±2.44)%與正常對照組間(81.00±3.33)%無明顯差別(P>0.05),但兩組都與海馬傘切斷組(56.00±2.00)%存在統(tǒng)計學(xué)上的差別(P<0.01,Fig.1)。在SON,三組動物的生理鹽水組間以及LPS組間均無明顯差別(P>0.05,Fig.2)。海馬傘離斷后免疫刺激對pvn神經(jīng)元活化的影響在既往的大量研究中,LPS刺激被用于模擬急性炎性-免疫反應(yīng),可引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的廣泛應(yīng)答。研究表明,這一作用主要是通過血中和腦內(nèi)的IL-1β、IL-6、TNF-α介導(dǎo)的。LPS刺激在腦內(nèi)廣泛區(qū)域內(nèi)誘發(fā)Fos表達,包括下丘腦PVN和SON中的OT能神經(jīng)元。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),OT主要由PVN和SON的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞合成,這些細胞在腦內(nèi)有廣泛的投射。OT作為中樞遞質(zhì)介導(dǎo)許多中樞功能活動。Neumann等的實驗證實,腦內(nèi)的OT抑制基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下HPA軸的活性。在大鼠腦內(nèi),許多腦區(qū)有OT受體,包括一些皮質(zhì)醇受體密集的腦區(qū),如下丘腦PVN、邊緣系統(tǒng)的海馬、杏仁核、隔區(qū)等,這為OT參與HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有證據(jù)表明,下丘腦PVN中的CRH能和OT能神經(jīng)元間存在著突觸聯(lián)系,這為OT參與調(diào)節(jié)ACTH的合成、分泌提供了最直接的依據(jù)。因此,觀察應(yīng)激時OT的變化,可能揭示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控下內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)正在或即將發(fā)生的相應(yīng)改變。Ericsson等用Fos蛋白作為神經(jīng)元激活的標志發(fā)現(xiàn)靜脈注射IL-1β后大鼠PVN神經(jīng)元處于興奮狀態(tài),其中大細胞部被激活的神經(jīng)元多為OT能。Yang等向腦室內(nèi)注射IL-1β后,也觀察到了PVN前大細胞亞核和內(nèi)側(cè)大細胞亞核OT能神經(jīng)元的活化現(xiàn)象。本實驗重點觀察了在部分失去海馬對下丘腦的支配之后,OT能神經(jīng)元對于腹腔LPS刺激所起的反應(yīng)發(fā)生了何種變化。考慮到腦部手術(shù)所致外傷、炎癥及繼發(fā)神經(jīng)元變性壞死、軸突潰變等對Fos蛋白表達的可能影響,本研究讓實驗動物在術(shù)后恢復(fù)28d后才進行LPS腹腔注射,意在消除急性手術(shù)應(yīng)激對腦內(nèi)Fos表達的影響,使觀察到的Fos表達情況能更接近于單純LPS干預(yù)所致的結(jié)果。早先已有實驗證明,海馬對HPA軸有抑制效應(yīng),阻斷海馬的膽堿能系統(tǒng)可以提高HPA軸對應(yīng)激的反應(yīng)性;同時,應(yīng)激狀態(tài)下海馬對外周的細胞免疫和體液免疫發(fā)揮抑制作用,以避免過于激烈的自身免疫給機體造成傷害。這一過程是通過交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素(NA)完成的。另一方面,腦內(nèi)的OT也抑制基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下HPA軸的活性;同時,Yang等的實驗證實了免疫應(yīng)答時PVN投射至延髓及脊髓自主神經(jīng)中樞的神經(jīng)元興奮,此投射主要為OT能,因此OT能神經(jīng)元也可能通過自主神經(jīng)調(diào)節(jié)免疫功能,對外周的細胞免疫和體液免疫發(fā)揮抑制作用。海馬和OT能神經(jīng)元對免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)所發(fā)揮作用的同一性提示我們進一步研究這二者之間有無內(nèi)在聯(lián)系。在本實驗中我們離斷了雙側(cè)海馬傘。已知海馬傘纖維起自CA2、CA3以及CA4的錐體細胞,形成海馬的主要傳出系統(tǒng),經(jīng)外側(cè)隔區(qū)、終紋床核、下丘腦前區(qū)至PVN的內(nèi)側(cè)小細胞部或是緊鄰PVN的腦區(qū),最終經(jīng)過神經(jīng)元間的突觸聯(lián)系支配內(nèi)側(cè)大細胞部的OT能神經(jīng)元。我們選擇重點觀察海馬傘離斷后免疫刺激時PVN內(nèi)OT能神經(jīng)元活化情況的改變,結(jié)果證實雙側(cè)海馬傘離斷的大鼠,在接受LPS刺激后,其OT能神經(jīng)元活化的數(shù)量雖然與接受生理鹽水的大鼠相比有顯著上升,但要大大少于接受同樣LPS刺激的對照組或假手術(shù)組的OT能神經(jīng)元活化的數(shù)量。這些結(jié)果說明切斷海馬傘的干預(yù)對于PVN中OT能神經(jīng)元的活化程度是有影響的。由此我們得出這樣的推論:海馬對HPA軸的抑制作用以及對免疫系統(tǒng)的抑制作用有一部分是通過支配PVN的OT能神經(jīng)元來完成的,當海馬對這部分腦區(qū)失去支配后,這一部分神經(jīng)元在免疫應(yīng)激時被激活的數(shù)目減少。SON的OT能神經(jīng)元在動物接受LPS刺激后也發(fā)生廣泛的活化,但是在雙側(cè)海馬傘離斷組、假手術(shù)組和對照組之間,活化細胞的百分率在統(tǒng)計學(xué)上并無差別。這一方面說明海馬傘的離斷對SON的OT能神經(jīng)元激活不構(gòu)成明顯影響,因為海馬并無傳出纖維支配到SON,另一方面也說明了SON的OT能神經(jīng)元活動可能受其它環(huán)路調(diào)控。下丘腦PVN內(nèi)側(cè)小細胞部是CRH能神經(jīng)元的聚集