基于rna干擾技術的ak2基因表達載體的構建及鑒定

基于rna干擾技術的ak2基因表達載體的構建及鑒定

近年來，這種人為干預是一種發(fā)展起來的反向遺傳穩(wěn)定技術。其作用機制是由外源性雙鏈rni通過21.23nm的雙鏈酪氨酸酶加工而成的。后者與蛋白質結合形成一個鈉誘導沉默配合物（risc）。在pt提供能量和解旋酶的幫助下，risc激活并打開了mrna。正義鏈被釋放，反義鏈起到了類似的檢測作用。risc以堿基互補配合原則為特定，并與目標mrna相結合。在不需要干預干預的情況下，mrna是切割的，叛亂片段被完全分解，以抑制基因的表達，并導致細胞失去特定基因的表型。2007年,我們針對傳導途徑中一種重要的編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因亞型Akt2構建具有短發(fā)夾結構的RNA干擾重組表達載體,為進一步探討該基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及腫瘤治療新方法提供實驗基礎。1材料和方法1.1prnat-u6.2表達質粒大腸桿菌JM109為鄭州大學基礎醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室保存的pGEM-TEasy載體,pRNAT-U6.2表達質粒購于南京GenScript公司,TaqDNA聚合酶、4×dNTP、T4DNA連接酶購自Promega公司,DEPC水、RNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司。1.2方法1.2.1分子身份證的合成根據GenBank數據庫提供的Akt2的mRNA基因序列(M95936),利用專門設計分析軟件進行設計,對上述候選序列通過美國生物技術信息中心的在線同源序列進行檢索,分別在96～114位點及525～543位點選擇19個堿基的核苷酸片段作為靶序列,即5′-GGTGTCTGTCATCAAAGAA-′及5′-AGTGACCATGAATGACTTC-3′,分析其GC%分別為42%及47%,并設計一條無關對照序列5′-TCTACGAGTCGCGGCATTC-3′,根據此序列分別合成正義鏈和反義鏈,此正義鏈和反義鏈包含19nts的基因序列且序列互補,中間加入9nts的發(fā)卡環(huán),3′端加入終止信號TTTTTT,5′末端加入BamHI酶切位點,3′端加入XhoI酶切位點,6條鏈均由上海生工合成。1.2.2火關于火分子的反應分別取兩條寡核苷酸片段各2μl,1×退火buffer46μl,反應條件:95℃5min,70℃10min,30℃維持30min,緩慢降至4℃。1.2.3pgem-trapu-t-u反應體系:2×Buffer5μl,T4DNA聚合酶1μl,膠回收PCR產物3μl,pGEM-TEasy載體1μl,4℃過夜。按常規(guī)操作方法將重組載體轉化感受態(tài)細胞JM109,經藍白篩選后用T7和SP6為引物進行PCR鑒定,得到pGEM-T-96、pGEM-T-525及pGEM-T-contral。1.2.4pcr擴增條件及條件pGEM-T-contral反應體系:10×buffer6μl,BamHI,XhoI酶3μl,質粒47μl,Milli-H2O1μl;反應條件:37℃酶切1h,70℃滅活5min。膠回收線性化的pRNAT-U6.2載體及發(fā)夾樣DNA片段96、525、contral并進行連接。反應體系:2×Buffer5μl,T4DNA聚合酶1μl,膠回收PCR產物3μl,pGEM-TEasy載體1μl。反應體系:2×Buffer5μl,目的基因Akt23μl,雙酶切的pRNAT-U6.2載體1μl,T4DNA連接酶1μl;4℃過夜。將連接產物再次轉化感受態(tài)細胞JM109,用pRNAT-U6.2的插入鑒定引物進行PCR鑒定,反應體系:10×Buffer3μl,4×dNTP2μl,pRNAT1引物0.5μl,pRNAT2引物0.5μl,TaqDNA聚合酶0.5μl,模板DNA5μl,Milli-H2O18.5μl。PCR反應條件:94℃預變性3min,94℃變性50s,55℃退火50s,72℃延伸60s,35個循環(huán),最后72℃延伸5min。陽性重組質粒送到上海生工測序。分別得到pRNAT-U6.2-96、pRNAT-U6.2-525及pRNAT-U6.2-contral。2結果2.1陽性重組質粒的構建單鏈DNA退火產物與pGEM-TEasy連接后,轉化JM109,藍白篩選后以T7/SP6作為引物進行PCR擴增。由于T7/SP6是pGEM-T載體的通用引物,其自身擴增片斷長度是176bp,加上插入的目的片斷70bp左右,陽性重組質粒擴增片斷長度應接近250bp。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,在接近250bp處有特異性條帶,與預先估計的片斷大小一致,且無其他非特異性擴增條帶。2.2prnat-u6.2-akt2-pcr擴增片段的鑒定目的基因與線性化的表達載體連接后轉化JM109細菌均得到10個以上克隆,以pRNAT-U6.2插入鑒定引物進行PCR擴增,得到約560bp的擴增片段,分別命名為pRNAT-U6.2-Akt2-96、pRNAT-U6.2-Akt2-525及pRNAT-U6.2-contral。2.3prnat-u6.2-akt2-126插入序pRNAT-U6.2-Akt2-96插入序列:GGATCCGGTGTCTGTCATCAAAGAATTCAAGAGATTCTTTGATGACAGACACCTTTTTTCTCGAG;pRNAT-U6.2-Akt2-525插入序列:GGATCCAGTGACCATGAATGACTTCTTCAAGAGAGAAGTCATTCATGGTCACTTTTTTTCTCGAG;對照序列:GGATCCTCTACGAGTCGCGGCATTCTTCAAGAGAGAATGCCGCGACTCGTAGATTTTTTCTCGAG;陽性重組載體插入序列測序的結果,與設計的發(fā)卡樣寡核苷酸序列比較結果完全一致。3新靶點分子和真核表達載體Akt是從人cDNA文庫中分離出來的與鼠類胸腺淋巴瘤病毒原癌基因同源的編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因片段,又名蛋白激酶B。Akt處于細胞內多種信號途徑的交叉口,是體內重要的生存信號通路PI3K/AKT的關鍵分子,它受上游生長因子、激素、細胞因子等多種因子調節(jié),被激活后與下游多種底物結合,從多個方面參與細胞的增生、凋亡、分化、代謝等過程,并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前,Akt已成為重要的腫瘤分子生物學治療的新靶點。Akt有三種亞型,分別為Akt1、Akt2、Akt3,其各自的生物學功能及在腫瘤治療中所處的地位尚不十分明確。王靜等研究顯示,Akt2及活化的Akt在非小細胞肺癌中高表達,且Akt2、CyclinD1和MMP-9在肺癌的發(fā)展中呈正相關;還有研究表明,以Akt2為靶點的siRNA可減少卵巢癌細胞增殖。本研究構建了具有發(fā)夾結構的Akt2的siRNA真核表達載體,旨在為進一步探討該基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及肺癌治療新方法提供參考。pRNAT-U6.2是新型高效真核表達載體,具有細胞核內轉錄小核RNAU6.2的作用原件,可準確啟動和終止轉錄信號,有效限制被轉錄RNA片段的大小,抵抗引起干擾素的非特異作用,且該表達載體具有SV40啟動子,可使所構建的載體在真核細胞內復制,增加細胞內siRNA轉錄的模板數,增強、加快和延長RNA干擾的效應;同時此載體上還引入了綠色熒光蛋白(GFP)及新霉素(neo)抗性標記,GFP便于追蹤轉