復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦水腫和血-腦屏障通透性的影響

復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦水腫和血-腦屏障通透性的影響

糖尿病合并腦梗死是糖尿病最常見、最嚴重的血管并發(fā)癥。死亡率高。與非糖尿病性腦病相比，糖尿病腦梗死的發(fā)病率和死亡率是非糖尿病性腦病的2.4倍。腦梗死是由于腦動脈粥樣硬化,使腦動脈管腔狹窄,血管內(nèi)膜損傷,合并多種因素致局部血栓形成,加重腦動脈狹窄甚至完全閉塞,導致腦組織缺血缺氧和壞死,進而引起各種神經(jīng)功能缺損的一種腦血管病。我們長期臨床應用復元醒腦湯治療腦梗死取得了顯著的臨床效果,為了進一步探討復元醒腦湯對腦梗死治療的作用機理,本實驗擬在建立糖尿病腦梗死大鼠模型的基礎上,觀測復元醒腦湯對其神經(jīng)功能缺損、腦組織含水量、血-腦通透性改變的干預作用。1實驗材料1.1實驗動物及其他選用120只SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20)g,購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院科技樓實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(滬)2011-009。1.2生物粉使用劑量復元醒腦湯,藥物組成:人參10g(單煎)、三七10g、石菖蒲12g、水蛭10g、益母草30g、生南星15g、制大黃9g(后下),由本院制劑室生產(chǎn)提供,濃度為388g生藥/L。1.3siga-aldricau2004FA2004B電子天平,上海精密科學儀器有限公司;大鼠腦立體定位儀,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;STZ,Sigma-AldrichInc(USA);凝血酶,Sigma-AldrichInc(USA);恒宇電熱恒溫鼓風干燥箱,上海躍進醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計,美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)。2實驗方法2.1模型準備2.2大鼠腦梗死超早期手術(shù)的分組在常規(guī)適應性分籠喂養(yǎng)后按照正常組24只、糖尿病模型組96只進行隨機分組,糖尿病模型組采用STZ腹腔注射法制糖尿病模型,造模成功后,連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2周,再從中隨機選取72只大鼠按糖尿病腦梗死模型組(簡稱模型組)24只、糖尿病腦梗死假手術(shù)組(簡稱假手術(shù)組)24只、糖尿病腦梗死治療組(簡稱治療組)24只進行隨機分配,其余24只作為糖尿病組。完成造模后,治療組每日按10.4g/kg體重,2次/d給予復元醒腦湯灌胃(參照陳奇主編《中藥藥理實驗方法學》依實驗動物與人體表面積比計算),模型組、假手術(shù)組、糖尿病組和正常組予等容量的生理鹽水灌胃,連續(xù)飼養(yǎng)7d。2.3觀察指標和方法2.3.1神經(jīng)缺損及阻力治療后每組隨機選取12只大鼠進行評分(根據(jù)Bederson等神經(jīng)缺損行為體征評分法):輕提鼠尾,使其頭部高于地面10cm,正常大鼠兩側(cè)前爪前伸。0級(0分):無明顯神經(jīng)缺損癥狀;Ⅰ級(1分):梗死對側(cè)前肢回收屈曲內(nèi)收,同側(cè)前肢向地面伸展;Ⅱ級(2分):Ⅰ級體征+俯臥于桌面時從梗死側(cè)向?qū)?cè)推動大鼠時阻力降低;Ⅲ級(3分):Ⅰ級體征+Ⅱ級體征+大鼠行走時向梗死對側(cè)肢體旋轉(zhuǎn)(呈追尾狀)甚至傾倒。分值≥1分,為模型制作成功。2.3.2腦含水量檢測腦組織含水量采用干濕腦重法測定。中藥灌胃治療7d后,每組隨機選取6只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后處死,迅速斷頭開顱取腦,取血腫周圍腦組織約100mg(各組取相應部位腦組織),用電子天平先稱取濕重,然后放入電熱恒溫鼓風干燥箱在100℃下烘烤24h至恒重再稱取干重,腦組織含水量計算公式:腦組織含水量=(濕腦重-干腦重)/濕腦重×100%。2.3.3pcr和cu中藥灌胃治療7d后,每組各取6只大鼠,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,在腹股溝處切開皮膚暴露股靜脈,注入2%伊文思藍(20mg/kg)循環(huán)20min,迅速剪開肋骨暴露出心臟,將灌注針頭插入左心室,用動脈夾夾閉降主動脈,然后在右心耳處剪口,快速從左心室灌注生理鹽水總量約100mL,至右心耳流出無色液體后,迅速開顱取腦。各組均摘取相應部位血腫腦組織,稱重后浸入甲酰胺中,在54℃恒溫水浴箱中孵育48h后,以3500r/min轉(zhuǎn)速離心15min,將取其上清液置于紫外分光光度計(λ=632nm)下進行光密度值(OD)測定。腦組織中伊文思藍含量以OD/g濕腦組織表示,以伊文思藍含量(OD/g)代表腦血管通透性。2.4統(tǒng)計學處理方法應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;等級資料采用Ridit分析。檢驗效能以P<0.05為差異具有顯著性,P<0.01為差異具有非常顯著性。3結(jié)果3.1表1顯示了神經(jīng)缺損綜合征的評分3.2大鼠頸內(nèi)動脈血流試驗制備糖尿病大鼠模型:將STZ試劑溶于pH為4.6的檸檬酸鈉緩沖液中(現(xiàn)配現(xiàn)用),大鼠接受腹腔注射STZ試劑(50mg/kg),1周后成模(血糖>16.7mmol/L),并連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2周。實施自體血栓栓塞性大鼠腦梗死模型手術(shù)。(1)制作血栓:將模型組、治療組兩組糖尿病大鼠用3%戊巴比妥鈉液按0.15mL/100g劑量麻醉后,暴露股靜脈,抽取靜脈血0.5mL加入預先加有75U凝血酶的EP管中,立即混勻。然后用注射器吸取沉淀部分注入2根頭皮針塑料管內(nèi),靜置15min再打進盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中,洗掉凝血塊表面的紅細胞。在顯微鏡下選擇富含纖維素(深色)的血栓剪切成1～2mm的小段,再轉(zhuǎn)入pH為7.4的PBS緩沖液中恒溫(37℃)靜置5h使其凝縮,吸入EP50管中備用。(2)制作腦梗死模型:將大鼠按前法麻醉后用眼科鑷子鈍性分離出左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈。結(jié)扎頸外動脈,用動脈夾夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈,用提前制備好的1毫升注射器針頭(將針頭處折一個90°的平鉤)在頸外動脈上挑刺出一個小口。將吸入血栓的EP50導管由頸外動脈插入頸內(nèi)動脈,松開頸內(nèi)動脈上的動脈夾。緩慢將血栓注入頸內(nèi)動脈,用生理鹽水沖管后拔出EP50導管,結(jié)扎頸外動脈近心端。松開頸總動脈夾,縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組不將導管插入頸外動脈,其余操作與手術(shù)組相同,手術(shù)過程中控制動物肛溫在(37±0.5)℃。4從“血腦梗死”看復元部分糖尿病并發(fā)腦梗死,多見于中老年人,中醫(yī)學范疇為“消渴病”合并“中風”?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩?“女子七七”、“男子七八”,“天癸竭”,腎精虧虛合并形神俱傷可為本病的發(fā)病基礎。元代醫(yī)家沈金鰲認為“元氣虛為中風之根”,而消渴病患者往往病情遷延日久,臟腑功能衰竭,津虧無以濡養(yǎng),元氣生化乏源,痰瘀等病理產(chǎn)物“應運而生”。痰瘀互阻堵塞脈絡,導致經(jīng)筋氣血運行不暢,日久化火生風,風火相煽,遂發(fā)為“中風”。患者臨床多表現(xiàn)為頭痛眩暈、言語謇澀、肢體麻木、手足拘急、驟然昏仆、半身不遂等。我們在長期臨床研究中總結(jié)發(fā)現(xiàn),腦梗死的病因主要以元氣虛損為根本,痰瘀互結(jié)、痰熱生風為病機核心。痰、瘀為元氣虧虛導致的中間病理產(chǎn)物,是貫穿中風始終的病機特點,痰瘀互阻從而致使化風生熱,風火相煽,乃發(fā)“中風”。據(jù)此,我們采取扶持元氣為主,佐以逐瘀化痰、泄熱息風、醒腦開竅之法,以自擬復元醒腦湯(人參、水蛭、天南星、大黃、三七)治療腦梗死,取得良好臨床療效。而且在既往臨床研究中發(fā)現(xiàn),復元醒腦湯用于治療腦梗死能明顯提高臨床療效,降低病死率,減輕腦水腫以及改善患者神經(jīng)功能。腦水腫是急性腦血管疾病常見嚴重病理變化之一,主要表現(xiàn)為腦容積變大,顱內(nèi)壓升高。腦缺血后再灌注發(fā)生時,防御系統(tǒng)驟然受損,自由基迅速升高彌散,過度灌注會嚴重損傷腦血管內(nèi)皮細胞,并對微血管結(jié)構(gòu)造成破壞,血腦屏障即被破壞,毛細血管通透性隨之增高,大量大分子蛋白質(zhì)滲入血管間質(zhì),繼而可導致腦水腫發(fā)生。腦水腫出現(xiàn)之后腦組織的含水量必然增加,故測定腦組織含水量至今仍是反映腦水腫嚴重程度的重要指標。血-腦屏障位于血液與腦、脊髓的神經(jīng)細胞之間,由腦血管內(nèi)皮細胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成。腦的毛細血管屬于連續(xù)型,毛細血管內(nèi)皮細胞之間以緊密連接封閉,內(nèi)皮外有基板、周細胞及星形膠質(zhì)細胞突起的腳板圍繞。腦和脊髓在血-腦屏障的保護下能免受內(nèi)、外環(huán)境各種物理、化學因素的影響,而維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。在血-腦屏障損傷(如炎癥、外傷、血管病)時,血-腦屏障通透性發(fā)生改變,導致腦水腫、腦出血等嚴重后果,相關研究證實腦組織含水量的變化與血-腦屏障通透性呈正相關。本實驗結(jié)果證實糖尿病腦梗死模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)體征缺損,術(shù)后活動能力明顯減退,血-腦屏障的通透性顯著升高,腦組織含水量明顯增加,表明腦水腫在腦梗死發(fā)生及病情發(fā)展過程中扮演著重要角色,而且腦水腫的發(fā)生發(fā)展與血-腦屏障通透性的升高密切相關。而且復元醒腦湯可以有效保護血-腦屏障,減少再灌注損失對其造成的二次破壞,降低血-腦屏障通透性,降低糖尿病腦梗死大鼠腦組織含水量,減輕腦水腫對大鼠術(shù)后恢復的不良影響。這就