大豆異黃酮對(duì)孕期大鼠生殖性能的影響

大豆異黃酮對(duì)孕期大鼠生殖性能的影響

異黃酮主要由三種游離黃酮（gen）、大豆苷元（dadziein，dai）和大豆黃素（glycitit）組成。它是一類(lèi)天然植物雌激素,在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮雌激素活性約為雌二醇的1×10-5~1×10-3,具有雙向雌激素樣活性,在低劑量時(shí)與雌激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雌激素受體(estrogenreceptors,ER)表現(xiàn)為抗雌激素作用,中劑量時(shí)產(chǎn)生一定的雌激素活性,高劑量時(shí)可活化因雌激素不足未能活化的ER,產(chǎn)生雌激素增強(qiáng)效應(yīng);SIF與β-雌激素受體(estrogenreceptorsbeta,ERβ)的親和力比α-雌激素受體(estrogenreceptorsalpha,ERα)高;所以異黃酮發(fā)揮的效應(yīng)因其所作用組織器官雌激素受體水平、局部濃度、內(nèi)源性雌激素水平等不同而不同。近年來(lái)隨著大豆深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,出現(xiàn)了大量大豆?jié)饪s制品以及大豆異黃酮制劑等提純產(chǎn)品,許多食品中都添加有大豆?jié)饪s制品,如嬰幼兒配方奶粉等。人們對(duì)大豆異黃酮的接觸也超過(guò)了傳統(tǒng)意義上的膳食接觸水平。大豆異黃酮潛在的毒性作用也越來(lái)越受到人們重視?，F(xiàn)有研究中,對(duì)大豆異黃酮可能引起生殖毒性的最小劑量尚無(wú)確切定論,不同研究所得結(jié)果也不盡相同,特別是孕期暴露后,對(duì)雄性子代可能造成生殖毒性的劑量及不良后果缺乏相關(guān)性的研究。本實(shí)驗(yàn)即通過(guò)大鼠孕期子代生殖系統(tǒng)發(fā)育的最敏感期暴露大豆異黃酮,從基因水平研究探討大豆異黃酮對(duì)其子一代(F1)雄性大鼠睪丸組織中相關(guān)基因表達(dá)的影響及產(chǎn)生影響的可能機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)時(shí)熒光定量pcr試驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)SD大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物室),動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(軍)2007-017。大豆異黃酮(陜西森弗生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),SIF含量為98%);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司];Trizol(美國(guó)Invitrogen公司);苗勒管抑制物(mullerian-inhibitingsubstance,MIS)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450side-chaincleavage,P450scc)、ERβ引物[寶生物工程(大連)有限公司];Tu-1810紫外分光光度計(jì)(北京普析通用分析儀器廠(chǎng));icyclerPCR儀(美國(guó)BIO-RAD)。1.2大豆異黃酮灌胃染毒實(shí)驗(yàn)SD大鼠雄性20只,體重(230±20)g;雌性40只,體重(200±20)g,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后按雌:雄=2:1的比例合籠交配,次日晨雌鼠陰道涂片鏡檢,發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日為受孕第0天。共獲取40只孕鼠,將其隨機(jī)分成5組,每組8只:分別為對(duì)照組(0mg/kg大豆異黃酮組),大豆異黃酮25、50、150、450mg/kg組。各組在母鼠孕期第13~19天用花生油為溶劑進(jìn)行大豆異黃酮灌胃染毒。孕鼠產(chǎn)后第3天對(duì)各組子鼠進(jìn)行數(shù)量調(diào)整,使每只母鼠哺乳6只子鼠,子鼠雌:雄=1:1,喂至子鼠第18天時(shí),每組隨機(jī)抽取6只雄鼠處死取睪丸組織約100mg,剪碎后加入1mLTrizol試劑于-80℃冰箱保存。1.3實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)檢測(cè)包括三個(gè)步驟:第一步,按Trizol說(shuō)明書(shū)方法提取睪丸組織的總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值分析提取RNA的純度,OD值在1.8~2.0之間說(shuō)明純度較好。第二步,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,先將RNA配成50×10-6mg/L的濃度,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:RNA6μL,5×primeScriptTMBuffer2μL,PrimeScriptTMRTEnzymeMixⅠ0.5μL,OligodTPrime(50μmol/L)0.5μL,Random6mers(100μmol/L)0.5μL,加RNasefreedH2O至10μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃15min,85℃5s。第三步,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng):按PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系20μL,目的基因均由大連寶生物公司設(shè)計(jì)合成,內(nèi)參β-action由大連寶生物公司提供,待測(cè)基因擴(kuò)增條件:95℃8min30s;95℃10s,60℃1min,40循環(huán);95℃1min,55℃1min,55℃10s。擴(kuò)增后根據(jù)Ct值依次計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。表1為本研究所用的Real-timePCR的引物。圖1為實(shí)驗(yàn)中部分樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)圖。1.4各因素方差分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)檢驗(yàn)顯示各組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布,采用單因素方差分析進(jìn)行各組間的比較,先進(jìn)性方差齊性檢驗(yàn),各組方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示方差齊(PERβ=0.078,PP450scc=0.123,PMIS=0.082),采用LSD法進(jìn)行分析。2mrna的表達(dá)從表2中可以看出SIF對(duì)F1雄鼠出生后第18天睪丸組織中ERβ、P450scc、MIS基因的mRNA表達(dá)影響不同。與對(duì)照組比較,各SIF組可以明顯降低ERβ的基因表達(dá)(P<0.05);各SIF組P450scc基因表達(dá)未見(jiàn)明顯的降低(P>0.05);隨著SIF劑量增高M(jìn)IS基因的mRNA表達(dá)增加,在150mg/kg與450mg/kg劑量時(shí)增加明顯(P<0.01)。3大豆異黃酮對(duì)大鼠睪丸中er基在胚胎發(fā)育期,睪丸的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的苗勒管抑制物(MIS)和睪酮促進(jìn)雄性性腺的分化形成,MIS促使苗勒管退化,使泌尿生殖系統(tǒng)向雄性發(fā)展;睪酮使中腎管進(jìn)一步分化為附睪、輸精管、精囊。因此,在雄性性腺的形成以及睪丸的正常下降移行過(guò)程中,這兩種激素起著決定性的作用。缺少睪酮作用,將使中腎管退化,導(dǎo)致雄性性器官發(fā)育障礙;缺少M(fèi)IS將使副中腎管分化為子宮、輸卵管和陰道上部。膽固醇側(cè)鏈烈解酶是睪酮合成過(guò)程中關(guān)鍵酶之一,該酶的作用將直接影響睪酮的合成。在機(jī)體中,雌激素需要與相應(yīng)的受體結(jié)合后再發(fā)揮作用。有研究表明,在睪丸組織中,睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上存在著大量雌激素受體,因此雌激素可通過(guò)這些受體作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞對(duì)其功能和發(fā)育等產(chǎn)生影響。所以,在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育敏感期,如果外界因素影響到了MIS、P450scc和β-雌激素受體(ERβ)等的基因表達(dá)與分泌,將會(huì)使大鼠生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能受到影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,母鼠暴露于大豆異黃酮后,子鼠睪丸組織中ERβ基因的mRNA表達(dá)顯著降低,說(shuō)明大豆異黃酮可以作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞從而影響大鼠睪丸的發(fā)育和功能(我們暫時(shí)將這種綜合效應(yīng)稱(chēng)為“雌激素效應(yīng)”),這與劉兆平等的研究結(jié)果相似。由于雌激素是通過(guò)作用于雌激素受體來(lái)發(fā)揮其作用的,所以當(dāng)體內(nèi)“雌激素效應(yīng)”過(guò)強(qiáng)時(shí),機(jī)體將通過(guò)調(diào)節(jié)降低雌激素受體的水平來(lái)降低雌激素效應(yīng),同時(shí)也間接反映了在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)SIF在子鼠體內(nèi)表現(xiàn)為較強(qiáng)的雌激素樣作用。作為睪酮合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶之一的P450scc,在本實(shí)驗(yàn)劑量條件下與對(duì)照組比較其mRNA表達(dá)有所降低,但無(wú)明顯差異(P>0.05)。MIS是由睪丸支持細(xì)胞分泌,作為哺乳動(dòng)物胚胎期性腺分化形成早期的關(guān)鍵基因,可以促進(jìn)苗勒管的蛻化并促進(jìn)雄性生殖系統(tǒng)的形成,但其過(guò)高表達(dá)時(shí)可以造成Wolffian管發(fā)育受損,睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育延遲或發(fā)育不全。因此,MIS在雄性生殖系統(tǒng)的表達(dá)通常是在子鼠出生后不久即出現(xiàn)明顯降低,但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIS基因表達(dá)在異黃酮高于150mg/kg時(shí)明顯增高(與對(duì)照組比較P<0.01),推測(cè)可能的原因是孕期接觸異黃酮所導(dǎo)致睪丸功能細(xì)胞發(fā)育滯后,睪丸支持細(xì)胞尚處在較為幼稚階段所致。MIS基因表達(dá)的高水平極有可能會(huì)干擾到睪丸間質(zhì)細(xì)胞的正常功能和發(fā)育。綜上所述,母鼠孕期接觸大豆異黃酮可能通過(guò)影響MIS和ERβ基因的改變對(duì)雄性生殖發(fā)育產(chǎn)生影響。并且各基因受大豆異黃酮影響的敏感度不同,如當(dāng)大豆異黃酮?jiǎng)┝繛?5mg/k