復(fù)元膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中igf-i、igfbp3表達(dá)的影響

復(fù)元膠囊對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨中igf-i、igfbp3表達(dá)的影響

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是老年人常見的一種常見的關(guān)節(jié)疾病，主要是關(guān)節(jié)軟骨的周期性退行性變。軟骨合成與降解失衡是其退變的主要病理機(jī)制,而細(xì)胞生長因子和炎癥細(xì)胞因子又是介導(dǎo)軟骨合成與降解失衡的重要生化因素。IGF-I作為一種具有促生長作用的重要調(diào)控因子,能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)合成,這與中醫(yī)“主骨生髓”觀點(diǎn)類似,因此常用補(bǔ)腎法防治骨關(guān)節(jié)炎。復(fù)元膠囊具有補(bǔ)腎活血作用,可通過降低炎癥因子IL-1β、IL-6表達(dá),抑制軟骨降解,但該方在促進(jìn)軟骨合成方面還有待于研究。本實(shí)驗(yàn)建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型,觀察軟骨IGF-I、IGFBP3表達(dá),探討復(fù)元膠囊防治膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。1材料和方法1.1復(fù)元膠囊的制備重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康新西蘭大白兔44只,雌雄各半,體重(2.5±0.4)kg。合格證:SCXK(渝)20090011。實(shí)驗(yàn)藥物復(fù)元膠囊由鹿茸、淫羊藿、生曬參、黃芪、丹參等組成,重慶希爾安藥業(yè)有限公司生產(chǎn),每粒膠囊重0.41g,相當(dāng)于生藥3g,僅供實(shí)驗(yàn)使用。對(duì)照藥物鹽酸氨基葡萄糖膠囊(奧泰靈)由香港澳美制藥公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字Z20088501),規(guī)格為每粒含鹽酸氨基葡萄750mg。IGF-I抗兔多克隆抗體、IGFBP3抗兔多克隆抗體、SP免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。1.2方法1.2.1小組將44只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組、復(fù)元膠囊低、中、高劑量組。正常組4只,其余各組8只,每只均單籠飼養(yǎng)。1.2.2現(xiàn)行膝關(guān)節(jié)培養(yǎng)法所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同等條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,除正常組外,其余各組采用右后肢膝關(guān)節(jié)伸直石膏固定法造模:實(shí)驗(yàn)兔放入固定器,先剪去右后肢踝關(guān)節(jié)以上的兔毛,用醫(yī)用紗布裹上兩層,再用管型石膏將其伸直位固定,石膏外以透明膠紙封好,若石膏松動(dòng)或脫落者及時(shí)重新固定,持續(xù)6w,造成膝骨關(guān)節(jié)炎模型。1.2.3等效劑量及復(fù)元膠囊根據(jù)Meeh-Rubner公式,按成人(60kg)體表面積與家兔體表面積換算等效劑量,復(fù)元膠囊中劑量組給予等效劑量2700mg·kg-1·d-1,復(fù)元膠囊低劑量組1350mg·kg-1·d-1,復(fù)元膠囊高劑量組5400mg·kg-1·d-1,鹽酸氨基葡萄糖組90mg·kg-1·d-1。造模后1w開始給藥,除正常組和模型組外,各組藥物飲用水溶解后灌胃,1次/d,持續(xù)6w。1.2.4骨下骨折組用藥6w后,處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,切取股骨內(nèi)側(cè)髁完整軟骨及軟骨下骨組織標(biāo)本,其中正常組取雙后肢軟骨做標(biāo)本,用4%多聚甲醛溶液固定20h,15%EDTA脫鈣3～5w,磷酸鹽緩沖液充分沖洗,石蠟縱向包埋固定,常規(guī)切片。1.2.5不同高倍視野的選取按照免疫組織化學(xué)染色法(SP法)操作說明檢測(cè)IGF-I、IGFBP3表達(dá)。每張切片選取6個(gè)高倍視野(400倍),其中三個(gè)視野包括表中層、三個(gè)視野包括中深層,由兩個(gè)不同觀察者完成。細(xì)胞染色為黃色或棕色為陽性細(xì)胞,參考Pelletier等方法計(jì)算每個(gè)高倍視野下的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。IGF-I、IGFBP3陽性軟骨細(xì)胞用細(xì)胞分?jǐn)?shù)表示。1.3統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用單因素方差分析,兩組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1各組小鼠海馬綠染色及胞核的染色正常組軟骨僅在表層和中上層見到少許陽性細(xì)胞;模型組軟骨細(xì)胞可見不同程度著色,軟骨細(xì)胞的胞漿及胞核可見黃色及棕色著色,IGF-I以核染色為主,IGFBP3以胞漿染色為主,軟骨各層均可見陽性細(xì)胞,但以中層更為顯著;模型組與鹽酸氨基葡萄糖組無明顯差異;復(fù)元膠囊各劑量組IGF-I表達(dá)陽性細(xì)胞增多,著色棕黃為主,IGFBP3表達(dá)陽性細(xì)胞相對(duì)減少,著色淡黃為主。見圖1。2.2模型各組igf-i、igfbp3表達(dá)積分的比較模型組IGF-I、IGFBP3表達(dá)積分與正常組比較均升高(P<0.01)。復(fù)元膠囊各組與模型組比較,IGF-I表達(dá)積分不同程度升高,而IGFBP3表達(dá)積分則不同程度降低(P<0.05,P<0.01),高劑量組顯著。復(fù)元膠囊中高劑量組與鹽酸氨基葡萄糖組比較,IGF-I表達(dá)積分升高,IGFBP3表達(dá)積分降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。3復(fù)元膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制IGF-I是人體內(nèi)一種與胰島素結(jié)構(gòu)相似的重要生長因子,主要由肝臟、骨及軟骨組織細(xì)胞合成,通過內(nèi)分泌、旁分泌或自分泌方式作用于靶器官,與組織細(xì)胞表面IGF-I受體結(jié)合后,激活PI3K和MAPK信號(hào)通路發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng),可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移,抑制細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)生長發(fā)育,機(jī)體代謝,抗衰老等過程,對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的損傷及修復(fù)具有十分重要的作用。在軟骨中IGF-I通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)多糖和膠原蛋白,抑制軟骨細(xì)胞凋亡,維持軟骨合成與降解平衡,但I(xiàn)GF-I這一生理效應(yīng)受胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)調(diào)控,IGFBPs與IGF-I結(jié)合可以降低IGF-I與其受體之間的親和力,從而抑制了IGF-I的生物活性。OA以軟骨退行性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn),勢(shì)必存在軟骨細(xì)胞分泌IGF-I不足,但事實(shí)上則相反,國外研究證實(shí)在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中IGF-ImRNA表達(dá)增加,比正常高3.5倍,IGFBP3表達(dá)也增加,且比正常高24倍。軟骨細(xì)胞合成IGF-I增加,理應(yīng)能夠促進(jìn)軟骨合成而發(fā)揮自我修復(fù),但是軟骨病理形態(tài)改變并沒有因此減輕,這可能與IGFBP3表達(dá)增加更多有關(guān)。IGFBP3表達(dá)增加,與IGF-I結(jié)合增多,抑制IGF-I與其受體結(jié)合,從而IGF-I促軟骨合成效能降低,導(dǎo)致軟骨退變。OA相當(dāng)于中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病多因年邁肝腎虧虛,氣血不足,風(fēng)寒濕邪侵入骨骼,以致血瘀阻經(jīng)絡(luò)所致。腎藏精,主骨生髓;腎精足則骨髓充,骨骼得以滋養(yǎng),筋骨堅(jiān)強(qiáng)。本病主要病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí),本痿標(biāo)痹,以腎精不足,筋骨失養(yǎng)為本,以痰濕血瘀,痹阻筋絡(luò)關(guān)節(jié)為標(biāo)。復(fù)元膠囊從臨床上治療骨關(guān)節(jié)炎行之有效的復(fù)元湯化裁而來,由鹿茸、淫羊藿、丹參、生曬參、黃芪等中藥配伍而成,具有補(bǔ)腎活血益氣之效。前期研究提示該藥可以通過降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨中IL-1表達(dá),增強(qiáng)TGF-β2表達(dá),調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs平衡起到防治骨關(guān)節(jié)炎的作用?，F(xiàn)代研究表明鹿茸提取物和淫羊藿提取物能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、基