【TRV注射液微生物污染實證分析5600字（論文）】

目錄TOC\o"1-3"\h\u第一章引言 1第二章產品介紹 12.1藥品概況 12.2影響 12.3風險 1第三章實驗內容 23.1試驗目的 23.2試驗原則 23.3材料 23.4材料 53.5薄膜過濾法 7第四章結果與分析 84.1試驗菌數回收率計算公式 84.2培養(yǎng)結果 84.3分析 10第五章結論 10

TRV注射液微生物污染實證研究摘要目的：建立TRV注射液微生物污染水平檢查方法并進行方法學驗證。方法：采用薄膜過濾法。根據2020年版《中國藥典》四部<1105>非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法。對3批TRV注射液進行微生物污染水平檢查的方法學驗證。結果：方法滿足無菌藥品微生物限度要求，并且具備可操作性。測試需氧菌總數，以檢測金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率，回收比值在要求范圍0.5-2.0內。結論：經微生物限度方法學驗證后，該微生物污染水平檢查方法可行有效。薄膜過濾法符合《中國藥典》2020年版（四部）通則1105的有關規(guī)定，可用于TRV注射液的微生物污染水平檢查。關鍵詞：TRV注射液；微生物限度；薄膜過濾法；方法學驗證引言根據米內網的最新數據，2019年中國公立醫(yī)療機構終端鎮(zhèn)痛劑市場規(guī)模接近184億元，樣本醫(yī)院的藥物銷售額呈現增長態(tài)勢，鎮(zhèn)痛藥僅次于腫瘤藥，其市場吸引了業(yè)界的關注。與治療領域的其他藥物相比，地佐辛注射液、阿司匹林腸溶片、酒石酸布托啡諾注射液、鹽酸丙帕他莫注射液、鹽酸羥考酮緩釋片、洛芬待因緩釋片等鎮(zhèn)痛藥保持了獨家品種的特殊現狀。因此，鎮(zhèn)痛藥仍在藍海市場中，并且存在很多市場機會。同時，鎮(zhèn)痛藥的生產和銷售受到了嚴格控制，專業(yè)性強、行業(yè)壁壘高。TRV注射液是恩華公司研制的仿制藥，屬于鎮(zhèn)痛藥，本實驗旨在建立一種準確、有效的檢驗方法，并在研發(fā)的基礎上對其進行驗證，從而為相關產品的安全使用提供依據[1-2]。第二章產品介紹2.1藥品概況藥品名稱：TRV注射液劑型：注射液規(guī)格：1ml：1mg、2ml：2mg、10ml：10mg、30ml：30mgTRV是一種新型小分子G蛋白偏向性配體[3-5]，它作用于μ-阿片受體（MOR），它旨在開發(fā)用于治療需要靜脈內阿片類藥物的成年患者的中度至重度急性疼痛，被美國FDA賦予突破性療法稱號。TRV注射液是我公司正在開發(fā)的注射劑，該產品為無色透明液體。其生產車間為凍干粉針劑車間，并采用滅菌過濾工藝。為了確保其微生物限度符合產品的要求，有必要確認微生物限度檢查方法以確保產品質量[6-8]。2.2影響TRV是由Trevena在美國發(fā)現和開發(fā)的，該公司擁有在中國開發(fā)和商業(yè)化TRV的獨家許可權利。該公司現已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局的批準，可以在中國進行TRV注射液臨 床試驗。該產品在美國的批準，將有助于加速其在中國的臨床試驗。臨床試驗完成后，公司將宣布該產品的生產批準。該產品的批準生產將進一步豐富公司的精神類和麻醉藥品的產品線[9]。對于市場，也贏得了一席之地。2.3風險TRV注射液（一種新的1類藥物）的上市申請已獲得美國FDA的批準，表明Trevena開發(fā)的TRV注射液已用于治療需要靜脈注射阿片類藥物的成年患者的中度至重度急性疼痛的適應癥已經獲得美國FDA的認可。目前，該產品在中國仍處于臨床研究階段，但是該產品在美國的批準，將有助于加速其在中國的臨床試驗和批準過程。藥品臨床試驗研究具有周期長、投資大的特點，該藥品臨床試驗的完成時間、進展、結果和未來產品市場競爭情況也存在許多不確定性。第三章實驗內容3.1試驗目的通過TRV注射液進行微生物污染水平方法學驗證，確定TRV注射液的微生物限度檢查方法，保證TRV注射液的微生物限度檢驗結果準確，保證產品質量。3.2試驗原則（1）方法學驗證應按照《中國藥典》2020年版的原則進行試驗。（2）供試品的方法學驗證應基于供試品的理化特性和生物學特性，并應采用適宜的方法制備供試液。（3）如果供試品具有抗菌活性，應盡可能除去或中和；檢查供試品時，如果使用中和劑或滅活劑，則應確認其有效性和對微生物的無毒性。（4）如果在制備供試液時使用表面活性劑，則應確認其對微生物無毒，并且所用中和劑或滅活劑要具有相容性。（5）方法學驗證應至少進行3批獨立的平行試驗，以確保學驗證方法的可重復性、有效性，并確保產品質量。3.3材料3.3.1試驗用具刻度吸管、鑷子、培養(yǎng)皿（?90mm）、剪刀、試管、無菌濾杯、無菌濾膜（0.45μmMixedCelluloseEsters(MCE)）等。3.3.2儀器與設備表1所用到儀器信息名稱型號編號有效期至生產廠家生化培養(yǎng)箱SPX-300BSH-ⅡC3-20842021.06.29上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司霉菌培養(yǎng)箱MJ-300B-ⅡC3-20122021.06.29上賀德實驗設備有限公司集菌儀HTY-2000B型C3-40062021.06.29浙江泰林生物技術股份有限公司生物安全柜BSC-1300-Ⅱ-A2C3-20632021.06.29蘇州安普生潔凈室設備有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱DGG-9620BDC3-40362021.06.29上海森信儀器有限公司立式壓力蒸汽滅菌器GR110DRC3-21252021.12.28致微（廈門）儀器有限公司立式壓力蒸汽滅菌器SQ510CC3-20862021.06.29重慶雅馬拓科技有限公司3.3.3菌種試驗用菌種試驗所用的菌株傳代次數不得過5代，菌種保存[10]中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。試驗用菌種（2ml：2mgZB-20191001）表2菌種名稱和編號菌種名稱來源菌種編號金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]南京樂診生物技術有限公司210208-01-4-3銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]南京樂診生物技術有限公司210208-02-4-2枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]南京樂診生物技術有限公司210208-03-4-2白色念珠菌[CMCC(F)98001]南京樂診生物技術有限公司210111-04-3-1黑曲霉[CMCC(F)98003]南京樂診生物技術有限公司210111-06-3-2試驗用菌種（2ml：2mgZB-20191002）表3菌種名稱和編號菌種名稱來源菌種編號金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]南京樂診生物技術有限公司210208-01-3-2銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]南京樂診生物技術有限公司210208-02-3-2枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]南京樂診生物技術有限公司210208-03-3-2白色念珠菌[CMCC(F)98001]南京樂診生物技術有限公司210111-04-3-1黑曲霉[CMCC(F)98003]南京樂診生物技術有限公司210111-06-3-3試驗用菌種（2ml：2mgZB-20191003）表4菌種名稱和編號菌種名稱來源菌種編號金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]南京樂診生物技術有限公司210303-01-3-2銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]南京樂診生物技術有限公司210208-02-3-2枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]南京樂診生物技術有限公司210303-03-3-2白色念珠菌[CMCC(F)98001]南京樂診生物技術有限公司210111-04-3-2黑曲霉[CMCC(F)98003]南京樂診生物技術有限公司210211-06-3-33.3.4培養(yǎng)基及緩沖液（1）培養(yǎng)基及緩沖液（2ml：2mgZB-20191001）表5培養(yǎng)基及緩沖液批號和效期名稱配制批號有效期至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基P21221020032022.02.19沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基202010012021.10.15胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基P21021020032021.03.18沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基P20721020032021.03.18pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液P21921020052022.02.170.9%無菌氯化鈉P22321020012022.02.03培養(yǎng)基及緩沖液（2ml：2mgZB-20191002）表6培養(yǎng)基及緩沖液批號和效期名稱配制批號有效期至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基P21221020032022.02.19沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基202010012021.10.15胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基P21021030012021.03.31沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基P20721030012021.03.31pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液P21921030022022.03.080.9%無菌氯化鈉P22321030012022.03.06（3）培養(yǎng)基及緩沖液（2ml：2mgZB-20191003）表7培養(yǎng)基及緩沖液批號和效期名稱配制批號有效期至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基P21221030012022.03.07沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基P20821030012022.03.15胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基P21021030012021.03.31沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基P20721030012021.03.31pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液P21921030022022.03.080.9%無菌氯化鈉P22321030012022.03.063.3.5供試品品名：TRV注射液；規(guī)格：1ml：1mg、2ml：2mg、10ml：10mg、30ml：30mg本文選擇2ml：2mg進行方法學驗證；批號：ZB-20191001、ZB-20191002、ZB-20191003;來源：江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司3.4材料3.4.1菌液制備金黃色葡萄球菌：取金黃色葡萄球菌菌種至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。用0.9%無菌NaCl溶液制成每1ml含菌量不大于100cfu的菌懸液，備用。銅綠假單胞菌：取銅綠假單胞菌菌種至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。用0.9%無菌NaCl溶液制成每1ml含菌量不大于100cfu的菌懸液，備用?？莶菅挎邨U菌：取枯草芽孢桿菌菌種至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。用0.9%無菌NaCl溶液制成每1ml含菌量不大于100cfu的菌懸液，備用。白色念珠菌：取白色念珠菌菌種至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20~25℃培養(yǎng)2~3天。用0.9%無菌NaCl溶液制成每1ml含菌量不大于100cfu的菌懸液，備用。黑曲霉：取黑曲霉孢子懸液，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌NaCl溶液稀釋成每1ml含菌量不大于100cfu的菌懸液，備用。上述菌懸液制備后如果在室溫下放置，應在2小時之內使用；若保存在（2～8）℃，可在24小時內使用。3.4.2供試品制備取2ml：2mg規(guī)格的TRV注射液50支，75%乙醇棉球擦拭后，用滅菌注射器將注射液全部轉移至含100mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的無菌輸液瓶內，混勻，作為一份供試液，如此制備供試液6份。3.4.3供試品制備（1）試驗菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。（2）試驗組用少量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將薄膜過濾器內的濾膜潤濕（用反復過濾器），取一份供試液和1ml試驗菌混合（使每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu），薄膜過濾后，再用300ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，取濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)、計數，每株試驗菌平行制備2張濾膜。（3）菌液對照組用少量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將薄膜過濾器內的濾膜潤濕（用反復過濾器），取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml和1ml試驗菌混合（使每張濾膜所濾過的菌液中含菌量不大于100cfu），薄膜過濾，取濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)、計數，每株試驗菌平行制備2張濾膜。（4）供試品對照組取一份供試液和1ml0.9%無菌NaCl溶液混合，薄膜過濾，再用300ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，取濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)、計數，平行制備2張濾膜。（5）陰性對照組用少量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將薄膜過濾器內的濾膜潤濕（用反復過濾器），取1ml0.9%無菌NaCl溶液薄膜過濾后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜3次，每次100ml，取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)、計數，平行制備2張濾膜。（6）培養(yǎng)條件將上述各微生物計數平板放入33℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉試驗，培養(yǎng)不超過5天；觀察并記錄菌落數[11-13]。3.5薄膜過濾法3.5.1設備和儀器反復過濾器、集菌儀、排液槽、酒精燈、無菌濾膜（0.45μm）、噴槍、不銹鋼鑷子、不銹鋼剪刀。3.5.2環(huán)境要求C級環(huán)境下A級層流中進行，實驗開始前先開半小時紫外燈照射臺面[14]。3.5.3準備工作樣品外包裝在準備室用75%乙醇溶液浸泡10秒中，然后通過傳遞窗傳到檢測室超凈工作臺內。3.5.4供試品準備在超凈工作臺內，用無菌剪刀打開外包裝，根據樣品稀釋要求，制備。3.5.5過濾將反復過濾器放置在漏液槽上，安裝泵管，首先用少量緩沖液潤濕濾膜，然后將樣品過濾，用適量沖洗溶液沖洗濾膜。拆下泵管，擰下反復過濾器，用無菌鑷子小心取下濾膜，將菌面朝上貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上[15]。3.5.6培養(yǎng)培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱內，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)5天。注：（1）操作過程中一定要有無菌意識，防止對樣品和環(huán)境造成污染。（2）沖洗量要在符合藥典和法規(guī)要求的同時通過方法驗證來得到。第四章結果與分析4.1試驗菌數回收率計算公式試驗組的回收比值＝試驗組的平均菌落數－供試品對照組的平均菌落數菌液組的平均菌落數標準：回收率應在0.5-2.04.2培養(yǎng)結果4.2.1供試品需氧菌總數計數方法學驗證結果（2ml：2mgZB-20191001）表8供試品需氧菌總數計數方法學驗證結果菌種名稱試驗組菌液對照組供試品對照組陰性對照組(cfu)試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值）菌落計數平均(cfu)菌落計數平均(cfu)菌落計數平均(cfu)金黃色葡萄球菌555960620000.956364銅綠假單胞菌757172711.006770枯草芽孢桿菌535556570.96575800白色念珠菌757781790.977977黑曲霉818276801.0383844.2.2供試品需氧菌總數計數方法學驗證結果（2ml：2mgZB-20191002）表9供試品需氧菌總數計數方法學驗證結果菌種名稱試驗組菌液對照組供試品對照組陰性對照組(cfu)試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值）菌落計數平均(cfu)菌落計數平均(cfu)菌落計數平均(cfu)金黃色葡萄球菌646671690000.966867銅綠假單胞菌616362731.006564枯草芽孢桿菌828585831.02888100白色念珠菌797678790.967380黑曲霉595766630.9055604.2.3供試品需氧菌總數計數方法學驗證結果（2ml：2mgZB-20191003）表10供試品需氧菌總數計數方法學驗證結果菌種名稱試驗組菌液對照組供試品對照組陰性對照組(cfu)試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值）菌落計數平均(cfu)菌落計數平均(cfu)菌落計數平均(cfu)金黃色葡萄球菌586062640000.946266銅綠假單胞菌767878800.988082枯草芽孢桿菌747476750.99747400白色念珠菌77787677.51.017979黑曲霉83858785.50.9987844.3分析薄膜過濾法是洗滌要測試的溶液，通過濾膜濾除殘留物質，將微生物留在濾膜之上，然后通過將膜貼在培養(yǎng)基上的方式來培養(yǎng)微生物[16-18]，培養(yǎng)規(guī)定時間后計數以判斷樣品是否符合標準。根據2020版《中國藥典》規(guī)定，薄膜過濾法中所使用的過濾膜孔徑應不大于0.45μm，本實驗中使用的濾膜孔徑為0.45μm，在沖洗量一定的情況下，實驗中所加入的供試品溶液幾乎可以將其完全沖洗掉，因此不能抑制菌落的生長[19-20]。還有就是關于黑曲霉的計數，應該每天進行觀察，因為黑曲霉容易擴散生長，不容易計數，所以白色菌絲生長出來就應該計數[21]。第五章結論通過TRV注射液進行微生物污染水平方法學驗證，確定TRV注射液的微生物限度檢查方法，保證TRV注射液的微生物限度檢驗結果準確，保證產品質量。經微生物限度方法學驗證后，該微生物污染水平檢查方法可行有效。薄膜過濾法符合《中國藥典》2020年版（四部）通則1105的有關規(guī)定，可用于TRV注射液的微生物污染水平檢查。參考文獻[1]光新蘭,張洪,戴鵬飛.薄膜過濾法在藥品檢驗中的應用[J].醫(yī)藥導報,2006(03):253-254.[2]楊曉莉,李輝,馬英英,繩金房,胡昌勤.中國藥典2020年版非無菌產品微生物限度檢查:微生物計數法解讀[J].藥物分析雜志,2020,36(06):1101-1107.[3]CaoxiaoYun,GuoYanjuandrugsmicrobiallimittestmethodvalidationtestsandrelatedtechnicalissues[J]PharmaceuticalTianjin,2006(06):49-51.[4]林福呈,李德葆.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)S9對植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理學報,2003(02):174-177.[5]XianglingQU,XianmeiXU,SibuMA,etal.ValidationofMicrobialLimitTestMethodsofCompoundGangbanguiCapsule[J].AgriculturalBiotechnology,2018(2).[6]戴有文.中國鎮(zhèn)痛藥市場分