細(xì)菌的分類(lèi)與鑒定

黃海2021.3細(xì)菌的分類(lèi)與鑒定1整理ppt內(nèi)容一、細(xì)菌的分類(lèi)概述 〔一〕通用分類(lèi)單元 〔二〕微生物的界級(jí)分類(lèi)學(xué)說(shuō)二、細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定 〔一〕生物分類(lèi)的兩種根本原那么 〔二〕細(xì)菌分類(lèi)鑒定的指標(biāo) 〔三〕細(xì)菌分類(lèi)鑒定的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)2整理ppt一、細(xì)菌的分類(lèi)概述 〔一〕通用分類(lèi)單元 〔二〕微生物的界級(jí)分類(lèi)學(xué)說(shuō)3整理ppt微生物分類(lèi)學(xué)〔microbialtaxonomy〕：是一門(mén)按微生物的親緣關(guān)系把它們安排成條理清楚的各種分類(lèi)單元或分類(lèi)群的科學(xué)。具體任務(wù)分類(lèi)〔classification〕鑒定〔identification〕命名〔nomenclature〕一、細(xì)菌的分類(lèi)概述4整理ppt命名(nomenclature)：根據(jù)命名法規(guī)，給每一個(gè)分類(lèi)群一個(gè)專(zhuān)有的名稱(chēng)。鑒定(identification或determination)：借助于現(xiàn)有的微生物分類(lèi)系統(tǒng)，通過(guò)特征測(cè)定，確定未知的、或新發(fā)現(xiàn)的、或未明確分類(lèi)地位的微生物所應(yīng)歸屬分類(lèi)群的過(guò)程。分類(lèi)(classification)：根據(jù)一定的原那么對(duì)微生物進(jìn)行分群歸類(lèi)，根據(jù)相似性或相關(guān)性水平排列成系統(tǒng)，并對(duì)各個(gè)分類(lèi)群的特征進(jìn)行描述，以便查考和對(duì)未被分類(lèi)的微生物進(jìn)行鑒定。5整理ppt〔一〕通用分類(lèi)單元七級(jí)分類(lèi)單元：

界(Kingdom)、

門(mén)(Phylum)、

綱(Class)、

目(Order)、

科(Family)、

屬(Genus)、

種(Species)。大腸埃希氏菌界：細(xì)菌界門(mén)：變形菌門(mén)(Bacteria)綱：γ-變形菌綱(Proteobacteria)目：腸桿菌目(Enterobacteriales)科：腸桿菌科(Enterobacteriaceae)屬：埃希氏菌屬(Escherichia)種：大腸桿菌種(coli)6整理ppt必要時(shí)可在兩級(jí)之間添加輔助單元，如亞門(mén)。七級(jí)分類(lèi)單元的第一個(gè)字母必須大寫(xiě)，而且整個(gè)名稱(chēng)用正體字表示。如：子囊菌綱Ascomycetes7整理ppt種：根本分類(lèi)單位，是一大群表型特征高度相似、親緣關(guān)系極其接近、與同屬內(nèi)其他種有著明顯差異的菌株的總稱(chēng)。種內(nèi)可進(jìn)一步分為亞種種是最根本的分類(lèi)單位。具有完全或極多相同特點(diǎn)的有機(jī)體構(gòu)成同種。性質(zhì)相似、相互有關(guān)的各種組成屬。相近似的屬合并為科。近似的科合并為目。近似的目歸納為綱。綜合各綱成為門(mén)。由此構(gòu)成一個(gè)完整的分類(lèi)系統(tǒng)。8整理ppt1.學(xué)名學(xué)名：一個(gè)菌種的科學(xué)名稱(chēng)，是按照?國(guó)際細(xì)菌命名法那么?命名的，國(guó)際學(xué)術(shù)界公認(rèn)并通用的正式名字。俗名：普通的、通俗的、地區(qū)性的名字，如：用“結(jié)核桿菌〞表示“結(jié)核分枝桿菌〞，大腸埃希氏菌(E.coli)通常稱(chēng)為大腸桿菌。9整理ppt采用“雙名制〞的國(guó)際植物命名法那么?！半p名制〞是瑞典植物學(xué)家林奈〔Linneaus〕于1953年介紹的植物命名原那么，該方法已廣泛用于植物、動(dòng)物、微生物的命名?！半p名制〞是用兩個(gè)拉丁文或拉丁化的其他文字組成的一個(gè)學(xué)名。2.學(xué)名的命名10整理ppt學(xué)名由屬名和種名組成書(shū)寫(xiě)時(shí)：屬名+種名；Escherichiacoli翻譯時(shí)：種名在前，屬名在后；印刷時(shí)，學(xué)名用斜體字；書(shū)寫(xiě)時(shí)，在學(xué)名下加一橫線(xiàn)表示斜體字母。如：Aspergillusniger或Aspergillusniger屬名〔曲霉〕種名〔黑〕11整理ppt3.屬名屬名：表示微生物的主要形態(tài)特征、生理特征或以研究者的人名表示。單數(shù)，字首大寫(xiě)。根霉屬、毛霉屬：形態(tài)特征丙酸桿菌屬、乳酸桿菌屬：生理特征+形態(tài)特征沙門(mén)氏桿菌屬：研究者的人名+形態(tài)特征12整理ppt4.種名種名：說(shuō)明微生物的顏色、形狀、用途，有時(shí)用人名、地名、微生物寄生的宿主名稱(chēng)和致病的性質(zhì)來(lái)表示。字母小寫(xiě)。黑曲霉——顏色巴斯德酵母——人名北京棒桿菌——地名豬霍亂沙門(mén)氏菌——寄生的宿主名稱(chēng)和致病性質(zhì)13整理ppt種名未確定：屬名加sp.〔單數(shù)〕或spp.〔復(fù)數(shù)〕表示。Bacillussp.一種芽孢桿菌Bacillusspp.假設(shè)干芽孢桿菌14整理ppt5.亞種、變種的命名亞種：subspecies，簡(jiǎn)稱(chēng)“subsp.〞變種：variety，簡(jiǎn)稱(chēng)“var.〞命名：三名法屬名+種名+〔subsp.或var.〕+亞種〔或變種〕可省略如：Saccharomycescerevisiaevar.ellipsoideus釀酒酵母橢圓變種Bacteroidesfragilissubsp.Ovatus脆弱擬桿菌卵形亞種15整理ppt6.新種的命名新種：屬名+種名+sp.nov.

如：Corymebacteriumpekinensesp.Nov.AS1.229

北京棒桿菌AS1.229新種16整理ppt★菌株〔在病毒中稱(chēng)毒株〕：表示任何由一個(gè)獨(dú)立別離的單細(xì)胞〔或單個(gè)病毒粒子〕繁殖而成的純種群體及其一切后代。一種微生物的每一個(gè)不同來(lái)源的純培養(yǎng)物均可稱(chēng)為該菌種的一個(gè)菌株?！锞甑拿Q(chēng)放在學(xué)名的后面，可用字母、符號(hào)、編號(hào)、研究機(jī)構(gòu)或菌種保藏機(jī)構(gòu)的縮寫(xiě)來(lái)表示。17整理ppt7.定名人、定名年份的表示屬名+種名+〔首次定名人〕+現(xiàn)名定名人+定名年份如：Escherichiacoli(Migula)CastellanietChalmers1919大腸桿菌Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn1872枯草芽孢桿菌18整理ppt〔二〕微生物的界級(jí)分類(lèi)學(xué)說(shuō)生物分界是把地球上的所有生物按照形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能、分布、生態(tài)等等特點(diǎn)而劃分成一個(gè)個(gè)比較接近的各種生物類(lèi)型集體的過(guò)程，生物分界是一項(xiàng)不斷進(jìn)行中的工作，隨著科學(xué)的開(kāi)展而不斷深化。陰影局部為微生物19整理ppt二界系統(tǒng)：植物界和動(dòng)物界兩界系統(tǒng)〔林奈〕傳統(tǒng)的分類(lèi)認(rèn)為界是最高級(jí)的分類(lèi)單位。在林奈時(shí)代，他以生物能否運(yùn)動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)，將生物劃分為兩界，即植物界和動(dòng)物界。將細(xì)菌、真菌等都?xì)w入植物界。1.微生物的分類(lèi)系統(tǒng)20整理ppt二界系統(tǒng)皂物〔山毛櫸科〕膏物〔睡蓮科〕核物〔核果類(lèi)〕〔豆科〕〔薺屬〕

叢物〔蘆葦屬〕羽物〔鳥(niǎo)類(lèi)〕〔龜類(lèi)〕〔鱉類(lèi)〕〔魚(yú)類(lèi)〕〔蛇類(lèi)〕毛物〔哺乳類(lèi)〕裸物〔人科〕

小蟲(chóng)之屬〔相當(dāng)于無(wú)脊椎動(dòng)物〕莢物植物

介物鱗物大獸〔相當(dāng)于脊椎動(dòng)物〕動(dòng)物生物〔古代稱(chēng)“物生〞〕21整理ppt三界系統(tǒng)：1866年E.N.Haeckel〔赫克爾〕提出動(dòng)物界、植物界和原生生物界〔單細(xì)胞生物、無(wú)核類(lèi)〕。由于顯微鏡的創(chuàng)造和使用，人們發(fā)現(xiàn)許多單細(xì)胞生物是有動(dòng)、植物兩種屬性的中間類(lèi)型的生物。如裸藻、甲藻等既可自養(yǎng)，有的也可異養(yǎng)生活。因而，赫克爾將原生生物〔包括細(xì)菌、藻類(lèi)、真菌和原生動(dòng)物、黏菌等〕另立為界，提出原生生物界、植物界、動(dòng)物界的三界系統(tǒng)。22整理ppt四界系統(tǒng)：1956年Copeland提出植物界、動(dòng)物界、原始生物界〔原生動(dòng)物、真菌、局部藻類(lèi)〕和菌界〔細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌〕。五界系統(tǒng)：1969年R.H.Whittaker〔魏泰克〕提出動(dòng)物界、植物界、原生生物界〔原生動(dòng)物、單細(xì)胞藻類(lèi)、粘菌等〕、真菌界〔真菌和酵母〕、原核生物界。隨著電子顯微鏡技術(shù)的開(kāi)展，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、藍(lán)藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)核膜、無(wú)核仁及膜結(jié)構(gòu)形成的細(xì)胞器，從而與其它真核細(xì)胞生物有顯著區(qū)別，應(yīng)該另立為界。于是，1959年，魏泰克根據(jù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度及營(yíng)養(yǎng)方式的不同，將細(xì)菌和藍(lán)藻、真菌從植物界中分出，分別另立為界，提出五界分類(lèi)系統(tǒng)：原核生物界〔包括細(xì)菌和藍(lán)藻等〕、原生生物界(單細(xì)胞真核生物)、植物界、真菌界和動(dòng)物界。23整理ppt五界系統(tǒng)它們組成了一個(gè)縱橫統(tǒng)一的系統(tǒng)，從縱向上看，它顯示了生命歷史的三大階段：即原核單細(xì)胞階段、真核單細(xì)胞階段和真核多細(xì)胞階段〔具有三個(gè)分支〕。在橫向上看，它顯示了生物演化的三大方向：營(yíng)光合自養(yǎng)的植物，為自然界的生產(chǎn)者；分解和吸收有機(jī)物的真菌，為自然界的分解者；以攝食有機(jī)物的方式進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)物，為自然界的消費(fèi)者〔同時(shí)又是分解者〕。24整理ppt六界系統(tǒng)：1977年我國(guó)學(xué)者王大耜在Whittaker五界系統(tǒng)根底上增加病毒界。三總界五界系統(tǒng)：我國(guó)學(xué)者陳世驤提出非細(xì)胞總界、原核總界〔細(xì)菌界和藍(lán)細(xì)菌界〕、真核總界〔植物界、真菌界、動(dòng)物界〕。25整理ppt三原界系統(tǒng)：1978年R.H.Whittaker和L.Margulis提出古細(xì)菌原界、真細(xì)菌原界、真核生物原界。分子生物學(xué)的開(kāi)展，特別是rRNA和rDNA的序列分析為整個(gè)生物界系統(tǒng)發(fā)育的研究提供了大量的數(shù)據(jù)。分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)已經(jīng)說(shuō)明，傳統(tǒng)的魏泰克五界系統(tǒng)并不完全代表生物的五個(gè)進(jìn)化譜系。伍斯〔Woese〕和伍夫〔Wolfe〕提出原核生物在進(jìn)化上有兩個(gè)重要分支，應(yīng)將原核生物分為二界：古細(xì)菌界〔甲烷菌、極嗜鹽菌和嗜熱嗜酸菌〕和真細(xì)菌界〔包括古細(xì)菌以外的其他原核生物，藍(lán)藻、真細(xì)菌等〕。真核生物分四界〔原生生物界、真菌界、動(dòng)物界和植物界〕。因此，提出六界分類(lèi)系統(tǒng)。1990年，伍斯根據(jù)分子生物學(xué)的研究資料，對(duì)生物分類(lèi)提出新的建議，認(rèn)為整個(gè)生物界可以區(qū)分為三個(gè)獨(dú)立起源的大類(lèi)群，即形成三個(gè)原界：古細(xì)菌原界、真細(xì)菌原界和真核生物原界。26整理ppt三原界系統(tǒng)27整理ppt二、細(xì)菌的分類(lèi)鑒定 〔一〕生物分類(lèi)的兩種根本原那么 〔二〕細(xì)菌分類(lèi)鑒定的指標(biāo) 〔三〕細(xì)菌分類(lèi)鑒定的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)28整理ppt〔一〕生物分類(lèi)的二種根本原那么：根據(jù)表型(phenetic)特征的相似程度分群歸類(lèi)，這種表型分類(lèi)重在應(yīng)用，不涉及生物進(jìn)化或不以反映生物親緣關(guān)系為目標(biāo)。按照生物系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性水平來(lái)分群歸類(lèi)，其目標(biāo)是探尋各種生物之間的進(jìn)化關(guān)系，建立反映生物系統(tǒng)發(fā)育的分類(lèi)系統(tǒng)。29整理ppt〔二〕細(xì)菌分類(lèi)鑒定的指標(biāo)

1.傳統(tǒng)指標(biāo)2.分子生物學(xué)指標(biāo)30整理ppt1.生物分類(lèi)的傳統(tǒng)指標(biāo)形態(tài)特征群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)等；個(gè)體：細(xì)胞形態(tài)，染色反響，各種特殊構(gòu)造等。從不同層次，用不同學(xué)科的技術(shù)方法來(lái)研究和比較不同微生物的細(xì)胞、細(xì)胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類(lèi)群特征的資料。31整理ppt生理生化反響營(yíng)養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長(zhǎng)因子等；酶：產(chǎn)酶種類(lèi)和反響特性等；代謝產(chǎn)物：種類(lèi)，產(chǎn)量，顯色反響等。32整理ppt生態(tài)特性： 生長(zhǎng)溫度，對(duì)氧的需要，宿主種類(lèi)等；生活史特點(diǎn)： 在生活史中出現(xiàn)的菌體變化特點(diǎn)及其規(guī)律性；血清學(xué)反響： 利用抗原構(gòu)造上的差異進(jìn)行鑒定；噬菌體的敏感性；其他33整理ppt2.生物分類(lèi)的分子生物學(xué)指標(biāo)DNARNA34整理ppt染色鏡鑒形態(tài)觀(guān)察按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行傳統(tǒng)的生化反響鑒定標(biāo)準(zhǔn)化成品鑒定產(chǎn)品〔如：API試劑條〕半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀〔如：ATBExpression〕

全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（如：VITEK2）色譜、光譜分析技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)1.生理生化檢測(cè)技術(shù)2.色譜、光譜分析技術(shù)3.分子生物學(xué)技術(shù)〔三〕細(xì)菌分類(lèi)鑒定的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)35整理ppt人工鑒定培養(yǎng)基的微量化、標(biāo)準(zhǔn)化和商品化數(shù)碼分類(lèi)鑒定技術(shù)〔生化反響的數(shù)字化〕自動(dòng)化鑒定技術(shù)〔生物信息的電腦化〕細(xì)菌的鑒定和藥敏試驗(yàn)都實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化1.生理生化檢測(cè)技術(shù)36整理ppt前期準(zhǔn)備增菌劃線(xiàn)別離染色鏡檢血清手工細(xì)菌鑒定手工鑒定流程37整理ppt1〕雙岐索引法Exampleofmethodsforidentification38整理pptTheBibleofmicrobiologists-Bergey’sManualofSystematicBacteriologyBergey'sManualofDeterminativeBacteriology-1ste1923Bergey’sManualofSystematicBacteriology-2nd

e2001伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)39整理ppt早在七十年代中期，一些國(guó)外公司就研究出借助生物信息編碼鑒定細(xì)菌的新方法。這些技術(shù)的應(yīng)用，為醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)工作提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、科學(xué)的細(xì)菌鑒定程序，大大提高了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。目前，微生物編碼鑒定技術(shù)已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，并早已商品化和形成獨(dú)特的不同細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。如API、Micro-ID、RapID、Enterotube和Minitek等系統(tǒng)。這種鑒定系統(tǒng)是自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)的根底。2〕數(shù)碼鑒定法40整理ppt數(shù)碼鑒定是指通過(guò)數(shù)學(xué)的編碼技術(shù)將細(xì)菌的生化反響模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)模式，給每種細(xì)菌的反響模式賦予一組數(shù)碼,建立數(shù)據(jù)庫(kù)或編成檢索本。通過(guò)對(duì)未知菌進(jìn)行有關(guān)生化試驗(yàn)并將生化反響結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字〔編碼〕，查閱檢索本或數(shù)據(jù)庫(kù)，得到細(xì)菌名稱(chēng)。其根本原理是計(jì)算并比較數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)每個(gè)細(xì)菌條目對(duì)系統(tǒng)中每個(gè)生化反響出現(xiàn)的頻率總和。數(shù)碼鑒定法根本原理41整理ppt微量生化反響系統(tǒng)Micro-ID系統(tǒng)VP硝酸鹽還原

苯丙氨酸脫羧酶硫化氫吲哚鳥(niǎo)氨酸賴(lài)氨酸丙二酸鹽尿素七葉甘ONPG阿拉伯糖側(cè)金盞花醇肌醇三梨醇421421421421421—+——+++——

—

+

+

+——

020021400021400

234

3

4相加所得數(shù)字：23434查出相應(yīng)細(xì)菌為：大腸埃希菌項(xiàng)目分值數(shù)碼鑒定法根本原理42整理ppt先將細(xì)菌別離純化。做染色形態(tài)觀(guān)察、氧化酶、糖發(fā)酵試驗(yàn)。根據(jù)染色、氧化酶、糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果選擇不同的生化反響板進(jìn)行接種〔同一個(gè)鑒定系統(tǒng)，配有不同細(xì)菌的生化反響板〕。培養(yǎng)后，讀取生化反響結(jié)果，得到一組數(shù)據(jù)。將這組數(shù)據(jù)查編碼本〔即數(shù)據(jù)庫(kù)〕，即得到鑒定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法：數(shù)碼鑒定法根本原理43整理ppt3〕自動(dòng)化的微生物鑒定和藥敏試驗(yàn)分析系統(tǒng)細(xì)菌數(shù)碼分類(lèi)技術(shù)是細(xì)菌自動(dòng)化鑒定技術(shù)的根底，細(xì)菌鑒定自動(dòng)化是把生化反響數(shù)字化技術(shù)進(jìn)一步電腦化，數(shù)據(jù)庫(kù)用電腦管理，結(jié)果用電腦分析和鑒定。鑒定系統(tǒng)的工作原理因不同的儀器和系統(tǒng)而異。不同的細(xì)菌對(duì)底物的反響不同是生化反響鑒定細(xì)菌的根底，而試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于鑒定系統(tǒng)配套培養(yǎng)基的制備方法、培養(yǎng)物濃度、孵育條件和結(jié)果判定等。大多鑒定系統(tǒng)采用細(xì)菌分解底物后反響液中pH的變化，色原性或熒光原性底物的酶解，測(cè)定揮發(fā)或不揮發(fā)酸，或識(shí)別是否生長(zhǎng)等方法來(lái)分析鑒定細(xì)菌。44整理ppt對(duì)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行鑒定與藥敏測(cè)試全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏檢測(cè)系統(tǒng)鑒定局部：51孔鑒定實(shí)驗(yàn)改進(jìn)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)顯色＋熒光檢測(cè)藥敏局部：85孔藥敏實(shí)驗(yàn)比濁＋氧化復(fù)原實(shí)測(cè)倍比稀釋MIC值藥物種類(lèi)與濃度梯度耐藥機(jī)制檢測(cè)同步進(jìn)行鑒定/藥敏復(fù)合板設(shè)計(jì)46整理ppt47整理ppt48整理ppt鑒定原理45種反響底物。檢測(cè)板每20分鐘檢測(cè)一次Green,blueandred

檢測(cè)顯色反應(yīng)UVlight檢測(cè)熒光反應(yīng)panel49整理ppt儀器判讀結(jié)果儀器自動(dòng)記錄每次判讀的每個(gè)反響孔的結(jié)果。將反響結(jié)果與上一次判讀結(jié)果進(jìn)行比較。當(dāng)兩次結(jié)果沒(méi)有差異，那么該反響結(jié)束。內(nèi)置的運(yùn)算法那么：顏色比率的變化依時(shí)間而變的數(shù)據(jù)庫(kù)：2、3、4、6、12小時(shí)，依據(jù)每個(gè)測(cè)試周期的判讀結(jié)果產(chǎn)生“百分比圖〞，如獲得足夠的信息，那么給出鑒定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)菌量,可信度＞90％，給出結(jié)果。50整理ppt鑒定性能鑒定能力

革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定>180種革蘭氏陽(yáng)性球菌革蘭氏陽(yáng)性桿菌

革蘭氏陰性菌鑒定>200種革蘭氏陰性發(fā)酵桿菌革蘭氏陰性非發(fā)酵桿菌無(wú)需附加實(shí)驗(yàn)95-96%準(zhǔn)確性鑒定時(shí)間

minimum 1:26hr maximum12:25hr average 3:24hr

median 2:26hr 95th% 6:26hr鑒定儀性能51整理ppt檢測(cè)流程純培養(yǎng)新鮮平板上挑取菌落制成標(biāo)準(zhǔn)濁度〔0.5~0.6麥?zhǔn)蠁挝弧车木鷳乙壕簠⒓尤鉁?，倒入檢測(cè)板，上機(jī)檢測(cè)。52整理ppt檢測(cè)流程掃描板條，輸入資料，等待鑒定結(jié)果。檢測(cè)流程53整理ppt2.質(zhì)譜、色譜、光譜分析技術(shù)MALDI-TOF特征蛋白指紋圖譜分析FT-IR紅外光譜分析FAME(fattyacidmethylester)GC-MS脂肪酸分析質(zhì)譜：定性、定量，可以推測(cè)物質(zhì)的組成；

色譜：定量，可分辨樣品中的不同物質(zhì)；

光譜：定性，確定樣品中主要基團(tuán)，確定物質(zhì)類(lèi)別54整理ppt質(zhì)譜分析鑒定技術(shù)—生物質(zhì)譜離子源(MALDI)質(zhì)量分析器

TimeofFlight(TOF)離子源

MALDI

ESI質(zhì)量分析器TOFIonTrap(IT)Quadrupoles(Q)FTMS+質(zhì)譜儀的類(lèi)型MALDI-TOF;MALDI-TOF/TOFESI-TOFESI-Qq-TOFESI-IonTrapESI-tripleQuadrupolesESI(orMALDIor….)FTMSESI(orMALDIor….)Q-qFTMS ………55整理pptE=U·z=1/2mv2

和

t=L/V

E：離子在加速電場(chǎng)獲得的動(dòng)能;U：加速電場(chǎng)電壓z：離子所帶電荷;m：離子質(zhì)量v：離子飛行速度;L：飛行管道長(zhǎng)度t：離子飛行時(shí)間;c：常數(shù)質(zhì)量分析范圍：500Da---100KDat=c·m/zMALDI-TOF質(zhì)譜的原理56整理pptLaserSample

plateAnalytemolecules

inmatrixAccelerationgridsDrifttubeIondetectorMassspectrumVacuumsystemVacuum

lock幾秒鐘即可得到結(jié)果MALDI-TOF-MS線(xiàn)性模式檢測(cè)57整理pptIntensityM/ZParentIonPeptideChainAr,HeorLaser571131289714787+7918699GlyLeuorIleLysProPheSer+P*TrpValDaughterIonGlyLeuorIleLysProPheSer+P*TrpVal對(duì)多肽進(jìn)行分析58整理ppt繪制肽質(zhì)量指紋圖(PMF)59整理ppt931.5131046.555354.201400.216110.064517.260647.358756.390263.14701000200030004000500060001002003004005006007008009001000m/z繪制肽質(zhì)量指紋圖譜——二級(jí)質(zhì)譜圖60整理ppt931.5131046.555354.201400.216110.064517.260647.358756.390263.14701000200030004000500060001002003004005006007008009001000m/z多肽的序列匹配——鑒定61整理ppt挑選菌落樣品制備于樣品盤(pán)上菌種鑒定結(jié)果未知微生物?

MALDI

BioTyper軟件-數(shù)據(jù)庫(kù)分析獲取質(zhì)譜指紋信號(hào)以蛋白為根底的分析方法(Proteinbasedapproach)1.樣品制備2.質(zhì)譜信號(hào)3.菌種鑒定質(zhì)譜分析的細(xì)菌鑒定流程62整理ppt直接涂抹法(DirectTransfer)單一菌種(Pureculture)涂抹單一菌落于樣品盤(pán)上(SinglecolonyonMALDI)Target加上1

ml基質(zhì)溶液(Overlaywith1mlHCCAMatrix)90-95%以上的常規(guī)樣品可于此制備法得到鑒定結(jié)果步驟1：樣品制備63整理ppt4364.065380.646254.646315.495096.017157.657273.876410.907870.628368.99010002000300040005000Intens.[a.u.]400045005000550060006500700075008000m/z質(zhì)譜圖:多數(shù)為核糖體蛋白(ribosomalproteins)信號(hào)大腸桿菌

(E.coli)步驟

2：采集譜圖64整理pptCalculationofamatchingscorebasedon:RelScore

%matchesofthereferencespectrum (e.g.6/10=0.6)

RelP-Num.

%matchesoftheunknownspectrum (e.g.6/20=0.3)I-Corr.

valueofintensitycorrelationUnknownmicroorganismismatchedagainsteachMainspectruminbiotyperlibrary.Rankingaccordingtomatchingscore,thresholdforIDMSP:MainSpectrumPeaks步驟

3：數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)65整理pptResultReport|DetectedSpecies|Ranking|actSc|maxSc|RelScore|PNk|PNb|PNm|RelP-Num.|I-Corr.|1000*Pro---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Spectrum#12|Ps.mendocinaDSM50017|1|3813|4271|0.89|41|10|83|0.55|0.88|438|Ps.oleovoransB396|2|1671|3450|0.48|14|8|83|0.22|0.39|41|Ps.fluoreszensB340|3|868|4186|0.21|6|7|83|0.11|0.19|4|Ps.veroniiDSM11331|4|847|4250|0.20|5|7|83|0.10|0.14|3|Ps.putidaDSM291|5|374|2821|0.13|3|3|83|0.05|0.12|1|Ps.putidaB401|6|329|2638|0.12|3|2|83|0.05|0.11|1譜圖模式比對(duì)進(jìn)行細(xì)菌鑒定66整理ppt得分范圍分?jǐn)?shù)的解釋2.300-3.000highlyprobablespeciesidentification完全可靠地鑒定到種的水平2.000-2.299securegenusidentification,probablespeciesidentification可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平1.700-1.999

probablegenusidentification有可能鑒定到屬的水平0.000-1.699

noreliableidentification沒(méi)有可信的鑒定結(jié)果微生物鑒定得分及含義67整理ppt

革氏陽(yáng)性

(GRAMnegativebacteria)

革氏陰性

(GRAMpositivebacteria)

非發(fā)酵菌

(Nonfermentingbacteria)

厭氧性細(xì)菌

(Anaerobicbacteria)

酵母菌

(Yeasts)

絲狀真菌(Filamentousfungi)數(shù)據(jù)庫(kù)含括超過(guò)2,185種物種,>5,100株菌株，超過(guò)100,000組質(zhì)譜信號(hào)CanIidentifyallkindofmicroorganisms?6869MALDIBiotyper1樣品~5分鐘96樣品(整盤(pán))~30分鐘生化反響測(cè)試鑒定法8小時(shí)–數(shù)天CanIidentifymicroorganisms

fast

?69整理pptAcetobacteracetisubsp.acetiAcetobacterpasteurianussubsp.lovaniensisAcetobacterpasteurianussubsp.pasteurianusActinomaduraaurantiacaActinomaduralibanoticaActinomaduralividaAgrobateriumtumefaciensArthrobacterglobiformisArthrobacteroxydansArthrobacterpyridinolisArthrobactersulfureusBacillusalcalophilusBacilluscohniiBacillussphaericusBrevibacillusbrevisBrevibacteriumlinensCellulomonasflavigenaCellulomonasturbataCorynebacteriumglutamicumComamonastestosteroniiGluconobacteroxydanssubsp.oxydansGluconobacteroxydanssubsp.oxydansGordoniaamaraeGordoniarubropertinctaGordoniaterraeHalomonasdenitrificansHalomonaselongataHalomonaselongataHalomonashalmophilaHalomonashalmophilaHydrogenophagaflavaHydrogenophagapseudoflavaMethylobacteriummesophilicumMethylobacteriumorganophilumMethylobacteriumradiotoleransMethylobacteriumrhodesianumParacoccusversutusParacoccusversutusPseudomonasbalearicaPseudomonasfluorescensPseudomonasfluorescensPseudomonasoleovoransPseudomonasputidaPseudomonasstutzeriPseudonocardiahydrocarbonoxydansRhizobiumleguminosarumRhodococcuscoprophilusRhodococcusfasciansRhodococcusgloberulusRhodococcusrhodniiRhodococcusrhodochrousRhodococcusruberSinorhizobiummelilotiStarkayanovellaStarkayanovellaStreptomycesalbusStreptomycesavidiniiStreptomycesazureusStreptomycesbadiusStreptomycesgriseusStreptomyceshirsutusStreptomyceslavendulaeStreptomycesphaeochromogenesStreptomycesviolaceoruberStreptomycesviridisporus>4600種微生物菌株，可直接應(yīng)用于微生物鑒定用戶(hù)可使用軟件自行生成新的微生物的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

模式并用于鑒定質(zhì)譜儀建立的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)〔主庫(kù)〕70整理ppt質(zhì)譜儀在生物分析方面還可以做什么

蛋白鑒定和蛋白質(zhì)組分析定量蛋白質(zhì)組學(xué)細(xì)菌鑒定血清多肽譜分析核酸分析分子成像71整理ppt血清多肽譜的分析血清樣品磁珠別離過(guò)程數(shù)據(jù)分析結(jié)果***疾病正常正常BindingWashingElutionMALDITOF檢測(cè)72整理ppt正常組疾病組疾病診斷標(biāo)志物的篩查73整理ppt3000400050006000m/z

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

300

320

340

360

380a.i.核酸的分析

74整理pptSNP位點(diǎn)的檢測(cè)位點(diǎn)1位點(diǎn)2引物275整理pptSNP位點(diǎn)檢測(cè)的質(zhì)譜圖引物剩余產(chǎn)物純合子純合子雜合子76整理ppt500070009000m/z

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140a.i.Polystyrene7000化學(xué)合成多聚物的分析

77整理pptGC比例分析分子雜交DNA脈沖場(chǎng)凝膠電泳16SrRNA寡核苷酸編目分析分子指紋圖譜分析基因測(cè)序分析其它3.分子生物學(xué)技術(shù)78整理pptGC比例分析DNAbasecomposition(GC%)通過(guò)GC構(gòu)成百分比判斷同源性79整理ppt分子雜交

DNA:DNAhybridization

80整理pptDNA-DNA雜交親緣關(guān)系相對(duì)近的微生物之間的親緣關(guān)系比較DNA-rRNA雜交親緣關(guān)系相對(duì)遠(yuǎn)的微生物之間的親緣關(guān)系比較核酸探針利用特異性的探針，用于細(xì)菌等的快速鑒定電子雜交隨著微生物基因信息，特別是全基因組完全測(cè)序的不斷增加，我們可以通過(guò)各種計(jì)算機(jī)軟件對(duì)不同物種的遺傳信息進(jìn)行直接比較，從而分析不同微生物間的親緣關(guān)系。81整理ppt82整理ppt83整理ppt16SrRNA寡核苷酸編目分析〔Ribotyping〕

84整理ppt分子指紋圖譜〔Molecularfingerprinting〕

PCR擴(kuò)增〔PCRamplification〕限制消化酶切〔Restrictiondigestion〕檢測(cè)Probing(Southernblotting)數(shù)據(jù)分析〔Dataanalysis〕85整理ppt基因測(cè)序分析-第二代測(cè)序技術(shù)SamplefragmentationLibr