Talen技術及誘導多功能干細胞(iPS)在醫(yī)學領域的發(fā)展應用

SIDANSAIBiotechnologyInnovatoronTALENtechnologyandStemCellresearchTalen技術及誘導多功能干細胞

在醫(yī)學領域的發(fā)展應用俞加海斯丹賽生物技術有限公司靶向基因修飾經(jīng)典難題：基因敲除（Knockout）什么是基因敲除：通過某種方法將一個特定靶基因破壞或失活，使其失去原有的功能。為什么要做基因敲除：基因敲除是尋找、證明基因功能過程中的必要步驟之一，是基因工程和基因治療的重要手段?；蚯贸姆椒ㄍ粗亟M

(HomologousRecombination)依賴DNA分子的互補性，經(jīng)典基因敲除方法特點：效率低（1per106cells），實驗周期長

RNA干擾(RNAinterference),反義寡核苷酸(Morpholino)依賴RNA分子的互補性：高效性，特異性；特點：臨時性，基因沉默而非敲除；鋅指核糖核酸酶（ZFN）DNA識別域(ZFP)

+非特異性核酸內(nèi)切酶構成（FokI)依賴DNA識別域的特異性：效率高但存在脫靶現(xiàn)象，專利被Sangamo壟斷基因敲除的方法TALEdomain:DNA識別域TALE，植物病原體黃單胞菌Xantomonas–用于調(diào)控宿主基因由34的氨基酸長度的重復單位構成第12，13位點氨基酸（repeat-variabledi-residue，RVD）不同RVD決定識別位點不同Nucleasedomain:DNA剪切域FokI，發(fā)現(xiàn)于海床黃桿菌Flavobacterium

okeanokoites

采取其非特異性DNA剪切結構域形成二聚體時發(fā)生剪切N’C’TALEFokILTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGNI→AHD→CNG→TNN→GA

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C新的里程碑技術：TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornuclease)TALEN切割雙鏈5’5’3’3’左臂右臂FokI

聚合DSBDoublestrandBreakNon-homologousEndJoining(NHEJ)HomologousRecombination(HR)無模板有模板GeneDisruptionGeneinsertionGenereplacementTALEN的應用DNA水平的基因敲除DNA水平的定點插入DNA水平的單堿基修飾（點突變）建立基因敲除/敲入的真核細胞系建立基因敲除/敲入的真核生物模型應用I:基因敲除NatBiotechnol2013Jan;31(1):23-4TALEN的實際應用應用II：基因敲入NatureBiotechnology29，731-734（2011）TALEN的實際應用應用III:點突變TALEN的實際應用TALEN廣泛應用Biotechnol

Bioeng.2013Mar18.doi:10.1002/bit.24890擬南芥短兵草牛蟋蟀果蠅倉鼠人青鳉小鼠線蟲大鼠水稻蠶煙草酵母斑馬魚青蛙豬構建TALEN質粒如何將這些高度重復的DNA片段連接起來？TALEN的組裝(GoldenGate)PCR3步Digest2步Ligate2步斯丹賽一步法只要4-5小時，這些片段就全部連接起來了一步連接123654913710121681411151718SoEASY??！SOFAST?。astTALETM連接TALENN’C’N’C’TALENmodulesat9positionsTALENbackbonevectorsTALENassembledvectorsPromoterFokIPromoterFokIx4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x4x16x16x16x4x16Position1Position2Position3Position4Position5Position6Position7Position8Position91/29x16dimers,7x4monomersCompletelibrary:172CMV,EF1a,Ubi,35S,T7,SP6MaximumRVDs:18.5MinimumRVDs:11.5多種TALEN骨架載體，滿足不同物種需求第一組載體：干細胞專用打靶載體，采用EF1α啟動子。第二組載體：構建動物模型專用載體，含有原核表達啟動子sp6或T7，便于體外轉錄。第三組載體：普通細胞打靶載體，采用CMV啟動子。第四組載體：植物專用打靶載體，采用ubiqutin或35s啟動子。TALEN質粒構建流程靶點設計挑克隆細菌培養(yǎng)DNA質粒抽提酶切鑒定得到測序正確質粒TALEN連接細菌轉化質粒測序鑒定Day1Day2Day3Day44天得到構建正確的TALEN質粒！簡單、快速！靶點設計DecideTALENtarget(leftarm/rightarm)TALE-NT2.0https://tale-/

DNASTARhttp:///Target:12-19bpSpacer:12-21bp5‘

end‘0’position:mustbeT為了得到高活性質粒，建議設計2X3組合。TALEN連接1.設計序列，

選擇模塊2.加樣，進行連接4-5h完成轉化至感受態(tài)細胞在Kana+LB平板中培養(yǎng)細菌轉化挑單克隆，細菌培養(yǎng)挑5-12個克隆（連接效率≈50%）Kana+LB培養(yǎng)液單克隆菌落將單菌落接入含5mlKa+的LB培養(yǎng)液的試管中DNA質粒抽提，酶切鑒定DNA質粒小抽提使用BamHI+PstI雙酶切，植物載體采用BamHI+SpeItarget:16nttarget:19nt左臂右臂1kbMarker1kbMarkerDigestionDigestionAsssemblylength:15x102=1530Asssemblylength:18x102=1836Onbackbone:531Totallength:1530+531=2061Onbackbone:531Totallength:1836+531=23671個單模塊（由34個氨基酸，即102個堿基組成）識別一個堿基上游引物305:5’-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3’下游引物306:5’-AGCTGGGCCACGATTGAC-3’S247引物：5’-GGGAGCACCCCTCAACCTGAC-3’質粒測序測序結果比對標準序列測序結果得到測序正確質粒305306測序正確質粒轉染Mixcell抽提基因組、PCR測序并進行TA克隆打靶效率細胞單克隆獲得穩(wěn)定敲除細胞系藥篩應用實例1細胞建系Hela細胞中XX基因敲除的穩(wěn)轉系建立：項目執(zhí)行時長2個月設計TALEN識別序列；構建TALEN載體；測序驗證質粒正確性實驗流程：序列100%正確脂質體轉染入Hela細胞中；puromycin藥物篩選3天收集篩選后剩余的部分細胞，抽提基因組DNA,進行PCRPCR產(chǎn)物送測序比對測序結果，初步確認TALEN活性續(xù)上大于53%（每100個細胞中有53個細胞發(fā)生堿基突變）PCR產(chǎn)物TA克隆、單克隆測序確定打靶效率續(xù)上2023/12/26最終挑選出陽性單細胞克隆，擴增，保存，穩(wěn)定遺傳系建立成功消化細胞呈單細胞，接種于96孔板中，待單細胞克隆長大后，同上進行鑒定部分單細胞克隆測序結果：單克隆鑒定結果表明：基因改變類型包括插入和缺失兩種形式，造成基因移碼突變，成功構建穩(wěn)轉系。根據(jù)打靶效率，挑取一定數(shù)量單克隆進行測序。續(xù)上根據(jù)測序峰圖，鑒定出雙拷貝敲除的單克隆打靶效率經(jīng)驗參考建立knock-out細胞系（雙拷貝敲除）：293T，hela細胞：建系成功率100%，目前成功建系19個，打靶效率約為30%-70%，最短耗時2個月ES/iPS細胞：建系成功率100%，目前成功建系7個，打靶效率約為20%-50%，最短耗時4個月數(shù)據(jù)統(tǒng)計至2013.07月打靶效率經(jīng)驗參考建立knock-in細胞系（單拷貝敲入）：293T、hela細胞等：建系成功率100%，目前已成功建系6個，打靶效率約為20%-55%，最短耗時3個月ES/iPS細胞：建系成功率100%，目前已成功建系2個，最短耗時5.5個月，打靶效率約為10%-28%數(shù)據(jù)統(tǒng)計至2013.07月應用實例2動物模型——斑馬魚Zebrafish-geneAWTTALEN580bpZebrafish-geneA(KpnI)WTTALEN580bp401bp179bpGenomicPCRRestrictiveenzymedigest斑馬魚內(nèi)XX基因敲除結果反饋我方設計TALEN識別序列；提供最終的TALEN質粒TALEN質粒線性化；體外轉錄顯微注射一細胞期受精卵48h后收集，抽提10-15個胚胎的基因組DNA，混合PCR擴增，酶切看結果打靶效率為80%以上應用實例3動物模型——小鼠設計構建TALEN打靶載體細胞水平TALEN活性檢測體外轉錄生成mRNA往受精卵注射mRNA嵌合體小鼠（F0）F1heterozygoteF2homozygote

應用實例3動物模型——小鼠leptinRFoundersidentificationbyT7E1mismatchsensitiveassayssequencesofTALEN-inducedmutationsinleptinRlocusindifferentstrains應用實例3動物模型——小鼠LeptinReceptorTALENedF0founderWTlittermateC57BL6strainFVBstrainLeptinReceptorTALENedF0founderWTlittermate斯丹賽部分成功案例

北京大學

張老師成功建立人ES細胞某基因敲除系北京大學

尹老師成功建立人結腸癌細胞某基因敲除系長征醫(yī)院周老師成功建立乳腺癌細胞某基因敲入細胞系清華大學

羅老師成功建立小鼠ES細胞某基因敲入系中國科學院生物物理研究所范老師成功建立小鼠MEF細胞某基因敲除系中國科學院上海生化所

宋老師利用培訓班拿到的平板直接建立倉鼠細胞某基因敲除系；細胞建系成功案例斯丹賽部分成功案例

華東師范大學

王老師成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率30%南京大學官老師成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率12.7%南方模式

費老師成功得到某基因敲除小鼠模型華東師范大學

李老師成功得到某基因敲除小鼠模型小鼠建模成功案例斯丹賽部分成功案例

中國科學院水生生物研究所

肖老師成功得到斑馬魚F1代雜合子，效率為14/16，并且后續(xù)得到F2代純合子復旦大學

姚老師成功得到斑馬魚某基因敲除的F1代雜合體

中國科學院健康科學研究所

荊老師成功的得到了斑馬魚突變體，打靶效率達20%；華中科技大學

劉老師成功得到斑馬魚某基因敲除的突變體；湖南師范大學

鄧老師成功得到斑馬魚某基因敲除的F1代雜合體F1代中突變體的概率約為30%斑馬魚建模成功案例斯丹賽部分成功案例

北京生命科學研究所王老師成功獲得F0突變體果蠅珠海威康健生物科技有限公司楊老師成功獲得F0突變體果蠅湖南師范大學鄧老師成功獲得F0突變體果蠅果蠅建模成功案例TALEN服務和產(chǎn)品1.TALEN試劑盒：15次/30次/60次。2.TALEN質粒構建服務：1）質粒構建

2）質粒構建及細胞水平活性檢測3.基因Knock-out或Knock-in細胞建系服務：

1）Knock-out細胞系；

2）Knock-in細胞系；

3）點突變細胞系。4.基因Knock-out或Knock-in動物模型

5.TALEN培訓班專業(yè)、完善的技術保障保證客戶得到高活性TALEN質粒并且最終建系/建模成功；擁有強大的技術團體，提供全程免費的技術支持；協(xié)助客戶完善TALEN平臺的構建；若發(fā)生建系/建模失敗，則全額退款。

培訓地點：上海市浦東新區(qū)蔡倫路720弄301室培訓時間：9:30-19:00培訓內(nèi)容：

TALEN技術相關講座：TALEN技術介紹、發(fā)展與應用TALEN構建的實驗室操作：根據(jù)設計好的TALEN序列 連接TALEN；TALEN技術疑難解答及討論。全國TALEN技術培訓班iPS細胞建系及臨床應用ShinyaYamanaka(山中伸彌)JohnGurdon(約翰·格登)2012年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者研究進展：干細胞是人體內(nèi)可以轉化為各種組織和器官的細胞，過去只能從胚胎中獲得。

2006年日本京都大學山中伸彌領導的實驗室在世界著名學術雜志《細胞》上首次報道了誘導多能干細胞（InducedPluripotentStemcells，iPS）技術研究。

2007年末，Thompson實驗室和山中伸彌實驗室?guī)缀跬瑫r報道，利用iPS技術同樣可以誘導人皮膚纖維母細胞成為幾乎與胚胎干細胞完全一樣的多能干細胞。

2008年4月，美國加利福尼亞大學科學家報告稱，他們將實驗鼠皮膚細胞改造成ips細胞，然后成功使其分化成心肌細胞、血管平滑肌細胞及造血細胞。

2009年2月，日本東京大學科學家宣布，成功利用人類皮膚細胞制成的ips細胞培育出血小板，而且從技術上說用ips細胞培育人類紅細胞和白細胞都是可能的；緊接著，日本慶應大學科學家又宣布，成功用實驗鼠的ips細胞培育出鼠角膜上皮細胞。

2009年3月伊始，ips細胞研究便相繼迎來兩項重大突破。英國和加拿大科學家發(fā)現(xiàn)了不借助病毒、安全將普通皮膚細胞轉化為ips細胞的方法；美國科學家則在《細胞》雜志上宣布，他們可以將ips細胞中因轉化需要而植入的有害基因移除，且保證神經(jīng)元細胞的基本功能不受影響。

2009年7月，ips細胞研究在臨床應用道路上又邁出非常重要的一步。據(jù)英國《自然》雜志網(wǎng)站23日報道，中國科學家周琪和高紹榮等人利用ips細胞克隆出活體實驗鼠，首次證明ips細胞與胚胎干細胞一樣具有全能性。該成果讓人們看到了ips細胞的實用性。

2010年7月，巴西圣保羅大學醫(yī)療系的科研人員最近通過改造皮膚基因獲取誘導多功能干細胞（iPS細胞）的科研成果。Oct4Sox2Klf4C-mycTALEN技術iPS細胞基因敲除

iPS細胞定點修復

iPS細胞定向分化體外研究：疾病模型建立;發(fā)病過程研究;疾病機理研究;藥物篩選體內(nèi)應用再生醫(yī)學人類iPS

產(chǎn)生流程用于iPS建立的體細胞來源皮膚成纖維細胞骨髓來源的細胞脂肪干細胞腸上皮細胞尿液細胞-----無創(chuàng)??！毛囊間充質干細胞。。。。。。

一切體細胞皆有可能！iPSCs臨床應用疾病模型建立疾病機理研究細胞替代療法發(fā)病過程研究藥物篩選帕金森癥PD脊髓性肌萎縮SMA鐮刀形細胞貧血癥α-1抗胰蛋白質酶缺陷癥......iPS細胞系的臨床應用1.疾病模型建立1.重編程設計(Oct4,Sox2,Klf4,Myc)2.定向分化（actinA,維甲酸，活化素A···）Virus,plasmid,protein,mRNACo-culturewithstroma,Treatmentwithcytokines神經(jīng)元心肌細胞肝細胞胰島細胞疾病模型—用于發(fā)病過程研究More: