DB22-T 3495-2023 露地辣椒疫病診斷與防治技術(shù)規(guī)程

65.020CCS

B

0522 DB22/T

3495—2023露地辣椒疫病診斷與防治技術(shù)規(guī)程Technical

code

of

managenment

of

pepperphytophthora

blight

in

open

吉林省市場監(jiān)督管理廳 發(fā)

布DB22/T

3495—2023 本文件按照

GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1起草。請(qǐng)注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)。孫西琳、王國宇。DB22/T

3495—20231范圍述了記錄與檔案的追溯方法。本文件適用于辣椒疫病診斷及露地辣椒疫病的綜合防治。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

8321

（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則NY/T

1276農(nóng)藥安全使用規(guī)范

總則3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。辣椒疫病

phytophthora

blight由辣椒疫霉菌（Phytophthora

capsici

）侵染辣椒引起的一種卵菌病害。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

chain

reaction，PCR用于體外擴(kuò)增特定

序列的技術(shù)。交替用藥

選擇作用機(jī)制不同的、無正交互抗性的藥劑交替使用?；旌嫌盟?/p>

mixed

選擇作用方式和機(jī)制不同、有減量增效作用的兩種藥劑混合使用。4 辣椒疫病診斷與防治技術(shù)程序的構(gòu)成辣椒疫病診斷與防治程序主要包括以下幾個(gè)階段，流程見圖

1。DB22/T

3495—2023圖1 辣椒疫病診斷與防治程序流程5 病害診斷癥狀診斷5.1.1 病害樣本采集在田間采集有代表性的發(fā)病植株，用于癥狀識(shí)別與病原菌鑒定。5.1.2 苗期癥狀呈立枯狀死亡。5.1.3 成株期癥狀成株期的根、莖、葉和果實(shí)都能發(fā)病。具體表現(xiàn)如下：a)

木質(zhì)部變淡褐色，引起整株萎蔫死亡，典型癥狀參見圖

；b)

萎，典型癥狀參見圖

A.2；c)

A.3；d)

枝上，典型癥狀參見圖

。5.2.2.1.1 采集具有典型疫病癥狀的發(fā)病組織，在病健交界處剪成

5

mm

～5.2.2.1.1 采集具有典型疫病癥狀的發(fā)病組織，在病健交界處剪成

5

mm

～10

mm

小塊，在超凈工作病原菌診斷5.2.1 顯微觀察5.2.1.1 徒手制片5.2.1.1.1 取潔凈的載玻片，在中間滴一滴清水，用潔凈的解剖針等直接挑取病部或培養(yǎng)基上的霉?fàn)钗?，置清水中，使病原物分散?.2.1.1.2 加蓋蓋玻片，使蓋玻片一側(cè)邊緣與水滴邊緣接觸，并慢慢放下蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，待顯微觀察。5.2.1.2 鏡檢在普通光學(xué)顯微鏡物鏡

×10

倍的視野下進(jìn)行形態(tài)觀察：a)

菌絲無色，無隔膜，形態(tài)圖參見圖

；b)

游動(dòng)孢囊梗

3

5

根成束由葉背氣孔伸出，具

3

個(gè)～4

個(gè)分枝，其頂端膨大形成游動(dòng)孢子囊，游動(dòng)孢囊梗膨大呈節(jié)狀，頂端尖細(xì),形態(tài)圖參見圖

；c)

～40）μm18～22）μm,

形態(tài)圖參見圖

B.3。5.2.2 分子檢測5.2.2.1 病原菌分離2 2臺(tái)上浸于

酒精中表面消毒

s，再用

3%次氯酸鈉消毒

2

min～3

min，用無菌水漂洗

3

5.2.2.1.2 取

4

小塊病葉置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂

（）培養(yǎng)基中，在

25

℃

光暗交替培養(yǎng)

2

d～4

d，切取單根菌絲頂端移至新的

PDA

培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。菌落圖參見圖

B.4。5.2.2.2 DNA

按

C.1

方法提取辣椒疫霉菌基因組

。5.2.2.3 ITS

擴(kuò)增以基因組

DNA

為模板，采用通用引物

ITS

4/ITS

5（ITS

4：5’’/ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）

對(duì)病原物

區(qū)域擴(kuò)增，

反應(yīng)體系按

C.2

的要求執(zhí)行。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果表明

序列長度約為

800

bp，檢測結(jié)果參見圖

C.1。5.2.2.4 BLAST

比對(duì)PCR

產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果在

GenBank

中進(jìn)行

BLAST

比對(duì)分析，確定辣椒疫病分離菌株(編號(hào)為

LJ10)P.

capsici

），其

ITS

序列長度為

bp，詳細(xì)序列參見

用

mega

7

鄰接法方法，基于

ITS

序列建立了辣椒疫霉菌(編號(hào)為

LJ10)的系統(tǒng)發(fā)育樹，參見圖

C.2。6 綜合防治防治原則熟好的有機(jī)肥作基肥；或每

m

施用商用有機(jī)肥

熟好的有機(jī)肥作基肥；或每

m

施用商用有機(jī)肥

、過磷酸鈣

30

kg、硫酸鉀型復(fù)合肥

病害防治應(yīng)采取“預(yù)防為主，綜合防治”的原則。在優(yōu)先選用抗病品種的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)栽培管理，突出綠色防控，科學(xué)使用化學(xué)農(nóng)藥。防治方法6.2.1 選擇抗病品種根據(jù)栽培習(xí)性及氣候條件，選擇抗病品種，優(yōu)先選擇兼抗兩種以上辣椒病害的品種。6.2.2 農(nóng)業(yè)防治6.2.2.1 合理輪作與玉米、大豆及十字花科蔬菜、蔥蒜類蔬菜等非茄科作物進(jìn)行

3

年以上輪作。6.2.2.2 清潔田園定植前徹底清理前茬作物的殘株、爛葉及雜草等。6.2.2.3 水肥管理2kg，N:P:K=1:0.5:1.2，適量增施中量元素及微量元素。蹲苗結(jié)束后，澆一次透水，視辣椒生長情況，隨膜下滴灌追施全營養(yǎng)水溶肥，或高鈣高鉀水溶肥，并交替使用。6.2.2.4 植株調(diào)整及時(shí)摘除門椒及門椒以下的側(cè)枝，并疏花疏果和整枝打杈。及時(shí)拔除田間病株。6.2.3 化學(xué)防治6.2.3.1 農(nóng)藥的選擇和使用

GB/T

8321

NY/T

1276

的規(guī)定。藥劑管理按附錄

D

的要求執(zhí)行。6.2.3.2 種子消毒播種前，首先是用

55

60

℃溫水浸種

20

，再用清水浸種

10

h～12

h，28

℃條件下催芽，每隔

h

用清水洗

1

次，發(fā)芽后適時(shí)播種。6.2.3.3 噴霧法

7

d～10

d

1

2

3

次。主要農(nóng)藥種類、作用方式、使用時(shí)期及施藥量參見表

。7記錄與檔案應(yīng)及時(shí)詳細(xì)做好診斷與防治各環(huán)節(jié)的記錄，并建立檔案，保存完好，檔案保存期限不低于

2

做到可追溯。DB22/T

3495—2023附 錄 A（資料性）辣椒疫病癥狀圖片A.1 辣椒疫病不同發(fā)病部位典型癥狀辣椒疫病典型癥狀圖片見圖

A.1～。圖

A.1

根部癥狀圖

A.2

莖枝部癥狀圖

A.3

葉部癥狀DB22/T

3495—2023圖

A.4

果實(shí)癥狀DB22/T

3495—2023附 錄 B（資料性）病原菌顯微形態(tài)及純化菌落形態(tài)B.1 病原菌顯微形態(tài)病原菌形態(tài)見圖

B.1～。圖

B.1

病原菌菌絲的形態(tài)(顯微鏡

10×10

倍數(shù))圖

B.2

(顯微鏡

10×10

)圖

B.3

病原菌游動(dòng)孢子囊(顯微鏡

10×10

倍數(shù))DB22/T

3495—2023B.2 病原菌純化的菌落形態(tài)病原菌在

培養(yǎng)基上生長的菌落見圖

。圖

B.4

病原菌在

培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)DB22/T

3495—2023附錄 C（規(guī)范性）CTAB

法提取病原菌基因組

DNAC.1 CTAB

法提取基因組

DNA

具體操作步驟C.1.1 將滅菌的研砵，研杵及藥匙備用，配置好的CTAB提取液置于

℃

水浴中預(yù)熱。C.1.2 先加入少量滅菌的石英砂于適量擴(kuò)繁的病菌菌絲體中迅速研磨后分裝于離心管中，再加入事先預(yù)熱的

CTAB

μL，反復(fù)顛倒震蕩，使其充分混溶，65

℃

水浴

1

h，期間每隔

15

min

拿出顛倒搖勻一次，并開蓋放氣，防止因?yàn)闅怏w受熱膨脹而使蓋子崩開。C.1.3 取出冷卻后，加入等體積的苯酚氯仿，輕輕翻轉(zhuǎn)，混勻后，常溫離心

（12000

）。C.1.4移取上清液至新離心管中，加入

2

倍體積的無水乙醇，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使

DNA

沉淀，待白色絮狀沉淀出現(xiàn)后，放置于

-20

℃

冰箱

30

min

以上，常溫離心

10

min（8000

）。C.1.5 棄上清液，吸取適量

的酒精于離心管中，輕輕搖勻，離心

5

min（8000

rpm），漂洗

2次，晾干后，加適量TE緩沖液，4

℃

溶解。C.1.6 用

的瓊脂糖凝膠電泳檢測

DNA。C.2 PCR

反應(yīng)體系和參數(shù)C.2.1 反應(yīng)體系ITS4

和

TIS5

引物各加

1

μL，PCR

mix

12.5

μL，DNA

模

板

1

μL，

H2O

μL，無菌水補(bǔ)足至

25

μL。C.2.2 反應(yīng)參數(shù)C.2.2.1 94

℃

預(yù)變性

3

，94

℃

30

s，

℃

30

s，72

℃

延伸

1

共

個(gè)循環(huán)，72

℃

℃

；將反應(yīng)混合物冷卻至

4

℃

，加入

10

的

EDTA

。C.2.2.2 PCR

產(chǎn)物檢測使用

％

的瓊脂糖凝膠，用

0.5×TBE

電泳緩沖液，

V

電泳

～min；C.2.2.3 在凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行電泳結(jié)果觀察，判斷是否為預(yù)擴(kuò)增長度的條帶，無非特異性條帶，且濃度大于

50

ng/μL。C.2.2.4 交由生物公司純化并測序。C.3 PCR

產(chǎn)物檢測電泳檢測病原菌

ITS

序列（樣品）片段大小約為

bp。DB22/T

3495—2023 圖

C.1

ITS

經(jīng)

擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果C.4 辣椒疫霉菌（P.

capsici

Leonian

全序列PCR

產(chǎn)物測序，確定了辣椒疫霉菌

序列片段大小為

。1CGGTTTCCGT

AGGTGAACCT

GCGGAAGGAT

61

TTGGGGGTCT

CATGGCGAAT

121

CGGTCCGGGC

GAGTAGCTTT

TTGTTTTAAA

181

GACGAAAGTC

TCTGCTTTTA

ACTAGATAGC

241

CATCGATGAA

GAACGCTGCG

AACTGCGATA

301

ATCGAAATTT

TGAACGCATA

TTGCACTTCC

361

TGTCCGTACA

TCAAACTTGG

CTTTCTTCCT

421

GTGAAGTGTC

TTGCGTGTTG

TCCTTCGGGT

481

TGTACTTCTC

TTTGCTCGAA

AAGCGTGGTG

541

AGTCGGCGAC

CGGTTTGTCT

GCTGCGGCGT

601

GTTGGCTTCG

GCTGAACAGG

CGCTTATTGA

661

GTGAACCGTA

GCTGTGTTTG

GCTTGGCTTT

721

GGCGGCTTCG

GCTGTCGAGG

GTCGATCCAT

781

ATCTCAATTG

GACCTGATAT

CAGGCAAGAT

AC.5 辣椒疫霉菌（P.

capsici

Leonian）發(fā)育系統(tǒng)樹基于

7

LJ10C.2。10DB22/T

3495—2023圖

C.2

序列利用

Mega

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹11序號(hào)制劑及劑型制劑作用方式制劑使用時(shí)期制劑用藥量mL/667m250%

35

35%

60

mL34%

25

mL35

440

75

mL

mL50%

20

80%

20

70%

150

72%

140

500

25

mL33

1075%

80

1120%

125

1247%

60

mL80

1370%

171

1423.4%

20

mL40

1550%

60

DB22/T

3495—2023附 錄 D（規(guī)范性）田間防治辣椒疫病的制劑D.1 15

種適用于田間防治辣椒疫病的制劑具體藥劑及使用方法等參見表

。表

D.1表

D.1

15

種田間防治辣椒疫病的癥狀DB22/T

3495—2023附 錄 E（規(guī)范性）農(nóng)藥管理E.1 采購不得采購國家禁止使用的農(nóng)藥，應(yīng)從正規(guī)渠道采購符合下列要求的農(nóng)藥，并索取發(fā)票或購藥憑證：a)

有資質(zhì)農(nóng)藥經(jīng)營單位經(jīng)營的；b)

有農(nóng)藥