出血型煙霧病的臨床與分子生物學相關因素研究

出血型煙霧病的臨床與分子生物學相關因素研究第一部分：出血型煙霧病的臨床相關因素研究背景煙霧病(Moyamoyadisease,MMD)是一種以雙側頸內動脈末端進行性狹窄或閉塞伴腦底異常血管網形成為特征的少見腦血管病,其中出血型煙霧病是重要的臨床類型,致死、致殘率高,臨床預后差。如何預防再出血是治療出血型煙霧病的關鍵所在。出血型煙霧病的最佳治療方案至今仍不明確,尤其在是否需要手術治療、手術時機、手術方式及手術效果等方面存在爭議。國內關于手術治療出血型煙霧病的大樣本、前瞻性臨床研究較少。目的探討出血型煙霧病的臨床與影像學特征及聯合腦血流重建術能否降低再出血率并改善臨床預后。方法2007年12月至2012年12月期間,復旦大學附屬華山醫(yī)院神經外科共211例出血型煙霧病住院患者納入此項單中心、前瞻性臨床研究。術前常規(guī)進行頭顱CT平掃、腦血管造影并分析出血部位、鈴木分期、脈絡膜前動脈-后交通動脈擴張Morika分級、有無伴發(fā)動脈瘤等。所有患者均接受手術治療,手術方式為聯合腦血流重建術。術后進行隨訪,記錄主要終點事件(術后30天內腦卒中及死亡、同側癥狀性再出血)及計算年再出血率。腦血管造影復查觀察吻合口通暢性、腦血流重建效果松島分級、煙霧血管減少程度、伴發(fā)微小動脈瘤是否消失、脈絡膜前動脈-后交通動脈擴張是否改善。結果1、211例出血型煙霧病患者中,年齡13-58歲(平均38.2歲),女性：男性為1.4：1,兒童(<18歲)9例(4%)。單純性腦室內出血94例(45%)、單純性腦內血腫37例(18%)、腦內血腫破入腦室75例(36%)、自發(fā)性蛛網膜下腔出血5例(1%)。伴發(fā)微小動脈瘤2例(1%)。術前出血側腦血管造影鈴木分期：Ⅰ期0例、Ⅱ期24例、Ⅲ期83例、Ⅳ期90例、Ⅴ期10例、Ⅵ期4例。術前腦血管造影脈絡膜前動脈-后交通動脈擴張Morika分級：出血側：1級75例、2級132例、3級4例；非出血側：1級141例、2級65例、3級5例,出血側Morika分級顯著高于非出血側(P<0.05)。2、211例出血型煙霧病患者中,失訪14例(6.6%),平均隨訪時間為36.1月。主要終點事件結果：手術側癥狀性再出血5例(2.5%),其中死亡4例(2.0%),重殘1例(0.5%),根據生存曲線分析計算出再出血率為1.87%/人/年。3、197例成功隨訪患者中,腦血管造影復查141例(75%)。吻合口通暢率100%；腦血流重建效果松島分級：A級90例、B級39例、C12例：煙霧血管減少：輕度減少(<25%)28例、中度減少(25%-50%)51例、顯著減少(>50%)62例；2例伴發(fā)微小動脈瘤均消失；腦血流重建術后脈絡膜前動脈-后交通動脈擴張改善：手術側：改善91例、未改善50例；非手術側：改善55例、未改善86例；手術側脈絡膜前動脈-后交通動脈擴張改善：非再出血側：改善89例、未改善47例；再出血側：改善2例,未改善3例；腦血流重建術后脈絡膜前動脈-后交通動脈擴張改善與再出血率降低明顯相關(P<0.05,OR2.846,95%CI1.755-4.615),而腦血管重建效果松島分級、煙霧血管減少與再出血率降低無顯著性差異(P>0.05)結論1、出血型煙霧病患者出血部位以單純性腦室內出血最多見,其次為腦內血腫破入腦室、腦血管造影鈴木分期以III-IV期為主。2、聯合腦血流重建術可以降低出血型煙霧病患者的再出血率并改善預后。3、聯合腦血流重建術能通過增加腦血流灌注減少煙霧血管、改善AChA-PComA擴張及伴發(fā)微小動脈瘤消失,影像學上提示再出血率降低可能與AChA-PComA擴張改善及伴發(fā)微小動脈瘤消失相關。第二部分：基于醫(yī)院患者的出血型煙霧病分子生物學相關因素研究背景出血型煙霧病患者發(fā)生出血或再出血,致死、致殘率高,臨床預后差,但其病因至今仍不清楚。近年來煙霧病的遺傳學研究發(fā)現了多個易感基因位點,其中環(huán)指蛋白(Ringfingerprotein,RNF)213基因近年來在多個研究中均證實與日本人群煙霧病相關,且R4810K位點顯著性相關,但是卻未深入分析基因型與臨床表型之間的關系。中國煙霧病患者日益增多,其中出血型煙霧病是重要的臨床類型,目前國內暫無相關基因研究。目的明確RNF213R4810K位點是否與醫(yī)院出血型煙霧病患者相關并進行RNF213基因測序尋找出血型煙霧病的易感基因位點。方法2007年1月至2011年12月期間,收集復旦大學附屬華山醫(yī)院神經外科煙霧病血標本170例、正常健康對照血標本507例。采用非標記探記高分辨率溶解曲線分析方法對RNF213R4810K進行基因分型,統計分析病例組與對照組中R4810K等位基因頻率及基因型、基因型與臨床表型之間有無差異。進一步對RNF213基因進行測序,尋找出血型煙霧病的易感基因位點。結果170例煙霧病患者中22例檢測到R4810K突變(13%),其中雜合突變21例、純合突變1例。507例正常健康人群中2例檢測到R4810K突變,均為雜合突變(0.4%),統計分析發(fā)現R4810K突變顯著地增加了煙霧病的患病風險(OR=36.7,95%CI：8.6-156.6,P=6.1E-15),進一步行基因型與臨床表型的相關性分析發(fā)現R4810K與缺血型臨床表型相關(OR=5.4,95%CI:1.8-16.1,P=0.001)。覆蓋RNF213基因外顯子40至68區(qū)域的基因測序發(fā)現了8個非R4810K位點：P4007R、Q4367L、A4399T、T4586P、L4631V、E4950D、A5021V和M5136I,其中A4399T突變率最高(4/20)。使用相同方法進行A4399T基因分型,發(fā)現170例煙霧病患者中28例檢測到A4399T突變(16.5%)、507例正常健康人群中45例檢測到A4399T突變(8.9%),與煙霧病顯著性相關(OR=2.0,95%CI:1.2-3.3,P=0.004),進一步行基因型與臨床表型的相關性分析發(fā)現A4399T與出血型臨床表型顯著性相關(OR=2.8,95%CI:1.2-6.5,P=0.014)。結論1、RNF213R4810K與缺血型煙霧病相關,而與出血型煙霧病無關。2、RNF213基因測序發(fā)現8個新位點：P4007R、Q4367L、A4399T、T4586P、L4631V、E4950D、A5021V和M5136I。其中A4399T與出血型煙霧病顯著性相關,提示A4399T可能為出血型煙霧病的易感基因位點。3、RNF213基因測序所發(fā)現的多個新位點提示煙霧病可能存在遺傳異質性。第三部分：基于社區(qū)人群的出血型煙霧病分子生物學相關因素研究背景基于醫(yī)院患者的出血型煙霧病基因研究已發(fā)現RNF213A4399T為出血型煙霧病的易感基因位點,但是研究對象均來自醫(yī)院住院患者。然而中國煙霧病發(fā)病以散發(fā)為主,RNF213A4399T與社區(qū)人群出血型煙霧病是否相關目前仍不清楚。目的明確RNF213A4399T是否與社區(qū)人群出血型煙霧病相關及進行全外顯子組測序尋找出血型煙霧病的易感基因位點。方法2013年1月至2013年10月期間,根據浙江省諸暨市出血型煙霧病的地區(qū)分布特征選取次塢鎮(zhèn)沈河村、大院村及白馬村進行社區(qū)流行病學調查。所有自愿參加的村民進行問卷調查、靜脈采血及頭顱MRA檢查。采用HRMA進行RNF213A4399T基因分型、頭顱MRA進行煙霧病篩查?？偨Y該地區(qū)出血型煙霧病的流行病學與臨床特征,統計分析RNF213A4399T是否與出血型煙霧病相關。同時收集該地區(qū)出血型煙霧病患者的血標本進行全外顯子組測序尋找出血型煙霧病的易感基因。結果1、596例村民參加社區(qū)出血型煙霧病的流行病學調查,其中537份調查問卷有效(90%),最終納入537例。2、537例入選村民中平均年齡51歲,其中女性352例(65.5%)。共確診煙霧病14例,均發(fā)現于沈河村。平均年齡52歲、女性8例(57.1%)、無家族史。其中出血型煙霧病9例(64.3%)、缺血型煙霧病1例(7.1%)、無癥狀型煙霧病4例(28.6%)。3、14例煙霧病患者中6例檢測到RNF213A4399T突變,其中純合突變1例、雜合突變5例。253例正常對照組中9例檢測到RNF213A4399T突變,均為雜合突變。9例出血型煙霧病患者中5例檢測到RNF213A4399T突變,其中雜合突變4例、純合突變1例。4例無癥狀型煙霧病患者中1例檢測到RNF213A4399T雜合突變。1例缺血型煙霧病患者中未檢測到RNF213A4399T突變。RNF213A4399T與社區(qū)人群出血型煙霧病相關(P<0.05)4、選取10例煙霧病患者及其健康一級直系親屬血標本10例進行全外顯子組測序,其中出血型煙霧病7例、缺血型煙霧病1例、無癥狀型煙霧病2例,結果共發(fā)現4個相關基因：RNF213、HLA-DRB5、KRTAP5-1及SYNE1。7例出血型煙霧病患者中4例檢測到R