生物工程下游技術(shù)第五章-細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液分離

第二篇目標(biāo)產(chǎn)品的別離與純化第五章細(xì)胞破碎、蛋白質(zhì)復(fù)性和固液別離細(xì)胞破碎固液別離初級別離(粗)純化精制下游技術(shù)根本過程下游加工技術(shù)的重要性1.產(chǎn)品別離純化是最終獲得商業(yè)產(chǎn)品的環(huán)節(jié)。2.投資費(fèi)用高〔抗生素、乙醇、檸檬酸占60%〕。3.別離純化技術(shù)落后會(huì)阻礙發(fā)酵工程技術(shù)的開展。幾種產(chǎn)品在發(fā)酵液中的濃度產(chǎn)品典型濃度〔g/L〕抗生素25氨基酸100酒精100有機(jī)酸100酶20蛋白質(zhì)10下游加工技術(shù)的特點(diǎn)1.發(fā)酵液的復(fù)雜性造成別離上的困難性。2.欲提取的產(chǎn)物通常濃度低且很不穩(wěn)定。3.多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。產(chǎn)物提純過程的不同決定于：

對象材料、目標(biāo)產(chǎn)物特性及對其純度的要求第一節(jié)概述基因工程生物制品別離純化:工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后，產(chǎn)生的有效成分含量很低，雜質(zhì)含量卻很高別離純化極其重要基因工程藥物從轉(zhuǎn)化細(xì)胞、生產(chǎn)，對產(chǎn)品的純度要求高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離包涵體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性濃縮初步分離高度純化制劑

產(chǎn)品基因工程制品別離純化的一般流程初級別離：別離細(xì)胞和培養(yǎng)液，破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物，溶解包含體〔包涵體〕，復(fù)原蛋白質(zhì)，濃縮產(chǎn)物，去除大局部雜質(zhì)等過程。主要決定產(chǎn)物的得率。純化精制：初級別離根底上，用各種高選擇性手段，主要是各種層析技術(shù)，將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能分開，使產(chǎn)物的純度到達(dá)有關(guān)要求。主要決定產(chǎn)物的純度。產(chǎn)物提純過程包括兩個(gè)根本階段：第二節(jié)細(xì)胞破碎目的：釋放細(xì)胞內(nèi)含物。分類：按照是否存在外加作用力分為機(jī)械法和非機(jī)械法。問題：破碎率是否越高越好？以大腸桿菌為宿主藥物多為胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞破碎方法分類圖1、高壓勻漿法組成：高壓泵和勻漿閥作用機(jī)理：高壓泵將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變成勻漿閥柱桿的直線運(yùn)動(dòng)，從高壓室〔幾十兆帕〕壓出細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過碰撞環(huán)的撞擊后改變方向從出口管噴出，使細(xì)胞經(jīng)歷較高的流速下的剪切碰撞發(fā)生較大的變形，從而到達(dá)破碎細(xì)胞的目的。高壓勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)液口出液口閥座碰撞環(huán)閥桿高壓勻漿器19.6-25.4MPa

適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎高壓勻漿法動(dòng)力學(xué)方程破碎效率與勻漿閥結(jié)構(gòu)、操作壓力和破碎次數(shù)有關(guān)：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：單位生物量釋放出的產(chǎn)物量〔mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常數(shù)；N：破碎次數(shù)；P：操作壓力；a:與微生物性質(zhì)有關(guān)的指數(shù)系數(shù)。破碎率---操作壓力----溫度控制----能耗溫度對活性物質(zhì)的失活作用提高壓力需增加能耗：3.5KW/100MPa移走熱量需付出代價(jià)：23.8℃/100MPa高壓勻漿一般需多級操作，每次循環(huán)前往往進(jìn)行級間冷卻勻漿過程中產(chǎn)生的熱→蛋白質(zhì)和酶的失活溫控和能耗堵塞〔不適合團(tuán)塊狀或絲狀真菌〕，質(zhì)地堅(jiān)硬者如包含體易損傷勻漿閥，也不適用溫度高易失活，能耗大。存在的問題2、高速珠磨法原理：細(xì)胞和極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間互相剪切、碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放內(nèi)含物。幾種常見珠磨器動(dòng)力學(xué)方程間歇操作:Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=Kt

其中，D=(1+K1

/j)j連續(xù)操作：Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K`上式中，t是破碎時(shí)間；K、K1、K`是破碎速度常數(shù)；V是破碎室內(nèi)懸浮液的體積；f是進(jìn)料速度；是平均停留時(shí)間；j是破碎時(shí)全混釜的數(shù)目，反映破碎室內(nèi)懸浮液的流動(dòng)狀況。采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控,效果較好;能耗與細(xì)胞破碎率成正比;問題：高壓勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好？溫控和能耗高壓勻漿法與高速珠磨法的比較項(xiàng)目高壓勻漿法高速珠磨法操作參數(shù)少多，液體損耗大連續(xù)操作時(shí)配備熱換器進(jìn)行級間冷卻兼具破碎和冷卻，減少產(chǎn)物失活達(dá)到較高破碎率需循環(huán)2-4次一次操作適用范圍團(tuán)狀、絲狀真菌、較小革蘭陽性菌不宜，包含體不宜幾乎所有的微生物細(xì)胞，包括含有包含體的基因工程菌的破壁X-Press擠壓機(jī)，把濃縮的細(xì)胞懸液冷卻至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥孔中擠出，冰晶體磨損和包埋在冰中的細(xì)胞變形引起細(xì)胞破碎。其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞碎片粉碎程度低，生物活性保持較好。3、超聲破碎機(jī)理：聲頻高于15～20kHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎機(jī)理尚未清楚，可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。破碎效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，液量損失少存在問題：使敏感物質(zhì)變性失活，噪聲大，大容量時(shí)效率低，應(yīng)用潛力有限?？栈F(xiàn)象：在強(qiáng)聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。錫箔紙測試空化強(qiáng)度與空化密度看得到的空化現(xiàn)象超聲波破碎儀大功率

超聲波破碎儀4、化學(xué)滲透法作用機(jī)理：某些有機(jī)溶劑，抗生素，外表活性劑，金屬螯合劑，變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)容物有選擇地滲透出來，這種處理方法叫滲透法。問題：EDTA、甲苯、TritonX-100、鹽酸胍和脲的作用機(jī)理？P70EDTA：破壞細(xì)胞的外層膜甲苯：溶解細(xì)胞膜的磷脂層TritonX-100：溶解內(nèi)膜的雙磷脂層鹽酸胍和脲：削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液優(yōu)點(diǎn)〔相對機(jī)械破碎〕：對產(chǎn)物釋出有一定的選擇性；細(xì)胞保持完整，碎片少，利于進(jìn)一步提??；核酸釋放量少，黏度低，便于進(jìn)一步別離。缺陷：時(shí)間長，效率低；化學(xué)試劑有毒；通用性差5、酶溶法機(jī)理：利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解。常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、β-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶〔protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽鏈內(nèi)切酶〔endopeptidase)、殼多糖酶(chitinase)、細(xì)胞壁溶解酶〔幾種酶的復(fù)合物〕等。優(yōu)點(diǎn)：一定的選擇性；細(xì)胞外形完整，核酸釋放少，有利于進(jìn)一步別離過程缺點(diǎn)：〔只能用于實(shí)驗(yàn)室〕產(chǎn)物抑制造成效率低下；溶酶價(jià)格高；通用性差，不易確定最正確條件；6、微波加熱法機(jī)理：微波加熱導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)，尤其是水分子吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖裂，形成微小孔洞，進(jìn)一步加熱可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞壁水分減少，細(xì)胞收縮，外表出現(xiàn)裂紋。優(yōu)點(diǎn)：微波穿透性強(qiáng)，選擇性高、加熱效率高。缺陷：一般只適合對熱穩(wěn)定物質(zhì)的別離；被處理的物料要具有良好的吸水性；不適于富含淀粉和樹膠等的天然植物機(jī)械破碎法與非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜碎片大小碎片細(xì)小細(xì)胞碎片較大內(nèi)含物釋放全部部分黏度高（核酸多）低（核酸少）時(shí)間，效率時(shí)間短，效率高時(shí)間長，效率低設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備通用性強(qiáng)差經(jīng)濟(jì)成本低成本高應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍克隆表達(dá)的產(chǎn)物基因工程細(xì)胞蛋白質(zhì)沒有活性，一級結(jié)構(gòu)正確，立體構(gòu)型錯(cuò)誤，無生物學(xué)活性！——包涵體第三節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)性難溶于水，只有在變性劑溶液中才能溶解。病毒在增殖的過程中，常使寄主細(xì)胞內(nèi)形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)——包涵體SEMofE.colicontaininginclusionbodiesSEMofisolatedwashedinclusionbodies包含體形成原因：〔比較復(fù)雜，目前尚不完全清楚。〕缺少某些協(xié)助因子〔分子伴侶？？〕或者由于周圍物理環(huán)境〔溫度等〕不適，使其難以連續(xù)進(jìn)行次級鍵的形成，中間產(chǎn)物相互凝集而積累形成包含體。應(yīng)該考慮的事：設(shè)法減少包含體的形成！

減少包涵體形成的策略1、

降低重組菌的生長溫度

降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。培養(yǎng)E.coli時(shí)添加高濃度的多醇類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌的蛋白質(zhì)聚集反響，在最適濃度范圍內(nèi)添加這些添加劑不會(huì)影響細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)的合成或運(yùn)輸，其它促重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑還有乙醇〔誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)〕、低分子量的巰基或二硫化合物〔影響細(xì)胞周質(zhì)的復(fù)原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成〕和NaCl。3、供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最正確培養(yǎng)條件如供氧、pH等。2、添加可促進(jìn)重組蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的生長添加劑蛋白質(zhì)的復(fù)性：包含體蛋白質(zhì)溶解于變性劑溶液中，呈變性狀態(tài)，所有的氫鍵、疏水鍵全部被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞，當(dāng)除去變性劑后，一局部蛋白質(zhì)可以自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)復(fù)性。如何使包涵體的構(gòu)型復(fù)原成正確狀態(tài)？包含體的別離及溶解別離包含體：對培養(yǎng)收集的細(xì)胞進(jìn)行破碎(高壓勻漿結(jié)合溶菌酶處理)，然后離心(5000~20000g/r)，可使大局部包涵體沉淀，與可溶性蛋白別離。洗滌：除去包涵體沉淀的脂類和膜蛋白，一般加去污劑〔TritonX-100或脫氧膽酸鈉〕和低濃度變性劑〔2mol/L尿素或鹽酸胍等〕。以防止包涵體溶解和復(fù)性的過程中重組蛋白質(zhì)的降解。溶解：包涵體的溶解必須用很強(qiáng)的變性劑，通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵而增溶蛋白。以異氰鹽酸胍的增溶效果最強(qiáng)，尿素稍差；去污劑〔如SDS〕可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白，但由于無法徹底去除而不允許用在制藥行業(yè)中；酸〔如70%甲酸〕可以破壞蛋白的次級鍵從而增溶蛋白，這種方法只適合少數(shù)蛋白質(zhì)。對于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶時(shí)應(yīng)參加復(fù)原劑〔如DTT、GSH、β-ME〕翻開蛋白質(zhì)中所有二硫鍵，對于沒有二硫鍵的目標(biāo)蛋白有時(shí)也應(yīng)使用復(fù)原劑，因?yàn)楹蜴I的雜蛋白會(huì)影響包涵體的溶解。同時(shí)還應(yīng)參加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA，用來螯合Cu2+、Fe3+等金屬離子以防止其與復(fù)原狀態(tài)的巰基發(fā)生氧化反響。蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理目前有多種不同的假設(shè)，但很多學(xué)者認(rèn)為有一個(gè)“熔球態(tài)〞的中間狀態(tài)，在“熔球態(tài)〞中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)根本形成，其空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模，再做一些局部調(diào)整就可形成正確的立體結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的具體步驟可用下式描述：伸展態(tài)→中間體→后期中間體→天然態(tài)體→聚集體核糖核酸酶的變性和復(fù)性示意圖(A)天然核糖核酸酶(B)變性失活(C)“錯(cuò)亂〞核糖核酸酶錯(cuò)誤發(fā)生的機(jī)制①復(fù)性過程中，局部折疊中間體的疏水簇外露，分子間的疏水相互作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。②伸展肽鏈折疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程受到周圍環(huán)境的影響，如溫度、pH值、離子強(qiáng)度、復(fù)性時(shí)間等因素的影響。不同條件下具體復(fù)性方式1、透析、稀釋和超濾復(fù)性法：最傳統(tǒng)、應(yīng)用最普遍，原理--使變性劑濃度降低到蛋白質(zhì)能恢復(fù)折疊的濃度。缺點(diǎn)：復(fù)性活性回收率低，而且難與雜蛋白別離。稀釋法大大增加溶液體積，不利于后續(xù)的別離純化，且處理量太大，不利于工業(yè)放大；透析法耗時(shí)長，易形成無活性蛋白質(zhì)聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染。2、高蛋白濃度下的復(fù)性方法：〔一個(gè)成功的復(fù)性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復(fù)性率。〕①緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白參加到復(fù)性緩沖液中,使得蛋白質(zhì)在參加過程中或參加階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性。因?yàn)橥耆郫B的蛋白通常不會(huì)與正在折疊的蛋白一起聚集。②溫度跳躍策略：變性蛋白在低溫下復(fù)性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉(zhuǎn)化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進(jìn)后期中間體快速折疊為蛋白的天然構(gòu)象。③復(fù)性在中等的變性劑濃度下進(jìn)行，變性劑濃度應(yīng)高到足以有效防止聚集，同時(shí)又必須低到能夠引發(fā)正確復(fù)性。3、添加促進(jìn)劑的復(fù)性方法：

包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性促進(jìn)劑的促進(jìn)作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)、改變錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、增加折疊復(fù)性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質(zhì)的溶解性。常用促進(jìn)劑：a、共溶劑：如通過與中間體特異的形成非聚集復(fù)合物，阻止蛋白質(zhì)分子間的相互碰撞時(shí)機(jī)，減少蛋白質(zhì)的聚集；b、去污劑及外表活性劑：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進(jìn)作用，但它們能與蛋白質(zhì)結(jié)合，很難去除；c、氧化-復(fù)原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復(fù)性過程中應(yīng)參加氧化復(fù)原體系，通過促進(jìn)不正確形成的二硫鍵快速交換反響，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率；d、小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集。e、0.4~0.6ML-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進(jìn)行，可大幅度地提高包涵體蛋白質(zhì)的折疊效率。9f、添加分子伴侶和折疊酶g、人工伴侶h、單克隆抗體I、其它：多聚離子化合物、甘油等。此外，有：4、液相色譜〔LC〕復(fù)性法：疏水相互作用色譜〔HIC〕、離子交換色譜〔IEC〕、凝膠排阻色譜〔SEC〕、親和色譜〔AFC〕已成功的對變性蛋白進(jìn)行了復(fù)性。其中HIC的別離效果較理想；SEC最差；鹽酸胍會(huì)在IEC柱上保存，與蛋白一起洗脫下來；AFC使用范圍窄、所需時(shí)間長、價(jià)格昂貴，。變性蛋白在HIC上的復(fù)性機(jī)理：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、變性劑和雜蛋白進(jìn)入HIC系統(tǒng)后，變性劑在柱上的作用力較弱，變性蛋白質(zhì)的作用力較強(qiáng)，變性劑首先同變性的蛋白質(zhì)別離，隨流動(dòng)相一起流出色譜柱。隨著流動(dòng)相的不斷變化，變性蛋白質(zhì)不斷地在固定相外表上進(jìn)行吸附-解吸附-再吸附，并在此過程中逐漸被復(fù)性，形成與天然蛋白質(zhì)構(gòu)象相同的蛋白質(zhì)，并流出色譜柱。液相色譜復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)：〔與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比〕在進(jìn)樣后可很快除去變性劑；色譜固定相對變性蛋白質(zhì)的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質(zhì)分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而防止了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質(zhì)復(fù)性的質(zhì)量和活性回收率；在蛋白質(zhì)復(fù)性同時(shí)，可使目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白別離到達(dá)純化的目的，使復(fù)性和純化同時(shí)進(jìn)行；便于回收變性劑，降低廢水處理本錢。5、反膠束復(fù)性法：外表活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核〞有機(jī)溶劑極性“頭〞極性的“核〞非極性“尾〞蛋白質(zhì)在反膠束內(nèi)水相中可以保持其構(gòu)象和活性，這樣可使蛋白質(zhì)相互別離，減少了蛋白質(zhì)折疊過程中的聚集作用。第四節(jié)固液別離別離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、包含體、沉淀物等的手段，不僅應(yīng)用于初級階段，而且也應(yīng)用于精制階段。一、離心沉降根據(jù)固體和液體之間的密度差,利用離心機(jī)提供的離心力實(shí)現(xiàn)固液別離。優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)易掌握；結(jié)果重復(fù)性好沉降的難易取決于固體物質(zhì)和液體的密度差,同時(shí)還取決于固體和液體的其他性質(zhì)以及離心機(jī)的離心能力.(可以顆粒沉降速度表示)斯托克斯公式(Stokes):Uc=d2(ρs-ρL)rω2/18μUc——顆粒沉降速度;d——顆粒直徑(假定為球形)Ρs——固體密度ρL——液體密度r——離心半徑;ω角速度;(rω2:離心力)μ——液體粘度別離因數(shù):a=(rω2:離心力)/ga——衡量離心力的大小主要指標(biāo),應(yīng)該主要是增大角速度而不是直徑。提高離心效果可通過增加轉(zhuǎn)速和延長時(shí)間來取得。(rω2:離心力):固液別離最重要的影響因素轉(zhuǎn)筒常規(guī)工業(yè)用離心機(jī)

〔--張家港華大離心機(jī)公司〕SSC型離心機(jī)為三足式上部人工卸料沉降離心機(jī)，該系列離心機(jī)裝鼓壁上無孔，屬沉降型轉(zhuǎn)鼓，操作維修方便。主要適用于固相顆粒細(xì)小，懸浮液粘性較大，過濾介質(zhì)再生困難，且含量較少的懸浮液的固液別離。

管式工業(yè)用離心機(jī)

〔--張家港華大離心機(jī)公司〕懸浮液從進(jìn)料管進(jìn)入轉(zhuǎn)鼓，固相顆粒在離心力場作用下受到離心力的加速沉降至轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁，沉降的顆粒在螺旋輸送器葉片的推動(dòng)下，從〔直筒段〕沉降區(qū)通過〔錐段〕枯燥區(qū)至固相出口排出；經(jīng)澄清的液相從溢流孔溢出。從而實(shí)現(xiàn)固、液相自動(dòng)、連續(xù)的別離?？蓱?yīng)用于脫水、濃縮、分級澄清等不同場合。

刮刀卸料工業(yè)用離心機(jī)

〔--張家港華大離心機(jī)公司〕主電機(jī)帶動(dòng)套裝的內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓全速旋轉(zhuǎn)，物料由進(jìn)料管引入轉(zhuǎn)鼓，在離心力作用下，液相物穿過濾布和內(nèi)轉(zhuǎn)鼓壁濾孔排出內(nèi)轉(zhuǎn)鼓，聚集到內(nèi)外轉(zhuǎn)鼓間的間隙內(nèi)，穿過到虹吸室的通孔進(jìn)入虹吸室，再由虹吸裝置抽走排出機(jī)外。固相物截留在內(nèi)轉(zhuǎn)鼓形成環(huán)形濾餅層。進(jìn)料到達(dá)預(yù)定容積后停止進(jìn)料，進(jìn)一步別離，此時(shí)可進(jìn)行洗滌。洗滌、別離結(jié)束，刮刀自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，將固相物刮下經(jīng)輸料螺旋排出機(jī)外，然后自動(dòng)洗網(wǎng)，開始下一個(gè)循環(huán)。二、微孔膜過濾根據(jù)流體各組分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，過濾別離微米級的細(xì)胞、細(xì)胞碎片和生物大分子的過程。何謂微孔膜過濾？切割分子量?MWCO微濾〔0.1~10μm)：別離固體顆粒超濾〔0.001~0.1μm)：濃縮大分子物質(zhì)反滲透〔<0.001μm)：從小分子中脫除水分微孔膜過濾的3種方式：缺點(diǎn)：技術(shù)難以掌握，影響因素多；穩(wěn)定性和重復(fù)性不好；膜堵塞問題難以解決！微孔膜過濾特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：容易做到封閉式操作，不受環(huán)境污染設(shè)備投資少，操作平安；加工量可大可小，十分方便；有利于別離密度差小而難以離心的固體，可直接用于下游的層析過程。微濾技術(shù)要點(diǎn)：選擇適宜的膜：①不與蛋白質(zhì)、脂類等發(fā)生吸附；②孔徑適宜。不銹鋼板式過濾器不銹鋼杯式過濾器正壓過濾器機(jī)電一體式微濾過濾系統(tǒng)微濾技術(shù)要點(diǎn)：2.選擇適宜的操作條件：過濾方程〔達(dá)西公式〕：V=ΔP/[μ(Rc+Rm)]V：過濾速度，ΔP：壓力差，μ：濾液粘度，Rc：濾餅阻力，Rm：過濾介質(zhì)〔膜〕的阻力。ΔP恒定，Rc增加，V降低保持V不變那么需阻止濾餅生成或不增厚。假設(shè)Rm和μ不變，那么V恒定，因?yàn)棣增加會(huì)加大Rc。3.膜材料的新開展——無機(jī)陶瓷膜優(yōu)點(diǎn)：〔機(jī)械強(qiáng)度大、惰性更大〕孔徑均勻，過濾效果好；耐蒸氣消毒、耐酸堿和有機(jī)溶劑；鞏固耐用，使用壽命長；可以加壓反向沖洗缺點(diǎn)：造價(jià)高；過濾面積?。槐憩F(xiàn)對蛋白質(zhì)一定的吸附；各種微孔膜柱及設(shè)備各種微孔膜柱及設(shè)備操作方式切向流過濾：〔懸浮液沿與濾膜水平的方向流動(dòng)，因此過濾過程中不斷帶走堆積在介質(zhì)外表的固體物質(zhì)，不會(huì)形成濾餅層而使膜堵塞。〕一種維持恒壓下高過濾速度的技術(shù)。原理：當(dāng)移走固體與固體沉積速率相同時(shí)，過濾速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的過濾速度。SartoconSlice整體型切向流過濾系統(tǒng)德國SartoriusVivaflow50盤旋流/切向流超濾器在膜外表加以攪拌造成流動(dòng)使膜相對于懸浮液運(yùn)動(dòng)〔將膜附于圓筒上高速旋轉(zhuǎn)〕切向流過濾的缺點(diǎn)產(chǎn)生的剪切力使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活，流速越快，失活越嚴(yán)重；懸浮液在流動(dòng)過程中有壓力損失，能耗消耗大；不能防止膜的污染和堵塞，當(dāng)膜的阻力增大時(shí)，無法防止過濾速度的下降；２、脈沖反洗切向流過濾原理：在切向流過濾中間歇地在膜的反面加一反壓，迫使局部濾液反透過膜以沖掉膜上的固體沉積和膜孔中的堵塞物，使過濾速度保持在比較高的水平。３、調(diào)整生化懸浮液的性質(zhì)調(diào)整pH值和離子強(qiáng)度；參加絮凝劑；參加過濾助劑〔硅藻土系列〕三、雙水相萃取原