丙泊酚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及分子機(jī)制的研究

丙泊酚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及分子機(jī)制的研究除心腦血管疾病之外,惡性腫瘤是引起人類死亡的另一主要死因,有數(shù)據(jù)資料顯示,每年在全球范圍內(nèi)惡性腫瘤造成700萬(wàn)人死亡[1]。在腫瘤患者接受腫瘤切除術(shù)、非腫瘤切除手術(shù)、及其他非手術(shù)治療過(guò)程中,腫瘤微環(huán)境(TumorMicroenvironment)及手術(shù)預(yù)后均有可能受到各種應(yīng)激創(chuàng)傷的影響。盡管麻醉學(xué)科在腫瘤患者圍手術(shù)期的作用尚未得到人們更深刻的認(rèn)識(shí),但越來(lái)越多的研究[2-4]發(fā)現(xiàn),麻醉藥物和應(yīng)激反應(yīng)可直接對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性產(chǎn)生影響,同時(shí)圍術(shù)期免疫功能的抑制亦可間接與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性改變產(chǎn)生相關(guān)性。女性健康深受卵巢癌的威脅,其病程的進(jìn)展與細(xì)胞信號(hào)通路及相關(guān)蛋白異常表達(dá)有關(guān)。而目前研究較多的標(biāo)志蛋白有基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloproteinase,MMPs)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signalRegulatedKinase,ERK1/2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VescularEndothelialGrowthFactor,VEGF)、E-鈣粘素(E-Cadherin,E-Cad)、以及缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducibleFactor-1α,HIF-1α)等[5-6]。由于卵巢癌患者早期缺乏特異性體征,臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)已較晚,因此往往失去手術(shù)機(jī)會(huì)。此外,卵巢癌還具有臨床療效差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、5年生存率偏低等特點(diǎn)[7]。隨著對(duì)高危因素的評(píng)估篩查、多種診斷方法的聯(lián)合應(yīng)用、微創(chuàng)技術(shù)以及多學(xué)科聯(lián)合治療的推進(jìn),卵巢癌的防治工作有所改觀,早期診斷機(jī)率顯著提高的同時(shí)改善了愈后[8]。結(jié)合卵巢癌易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、分子機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn),提示診療過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均應(yīng)該被關(guān)注。關(guān)于麻醉實(shí)施對(duì)腫瘤預(yù)后的影響實(shí)際上在上世紀(jì)已經(jīng)引起了關(guān)注,但是相關(guān)研究較少,回顧目前麻醉學(xué)與腫瘤學(xué)研究的現(xiàn)狀發(fā)現(xiàn),麻醉藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)影響的體外研究成為熱點(diǎn),并且丙泊酚是主要的代表藥物。丙泊酚作為卵巢癌患者圍術(shù)期經(jīng)常用到的麻醉藥物,僅僅關(guān)注其在應(yīng)激調(diào)控、麻醉藥物對(duì)比觀察等方面的研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。在既往麻醉學(xué)與腫瘤學(xué)研究的基礎(chǔ)上,揭示探討丙泊酚對(duì)卵巢癌生物學(xué)特性影響的必要性和重要性,從麻醉學(xué)角度探討該患者群體在接受手術(shù)、非手術(shù)鎮(zhèn)靜及特定醫(yī)療條件下(ICU病人及部分吸食毒品患者)對(duì)丙泊酚需求時(shí)的用藥方案制定,同時(shí)減少或者干預(yù)其對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響意義深遠(yuǎn)。關(guān)于丙泊酚[9-10]抗炎作用、免疫調(diào)控作用的文獻(xiàn)報(bào)道較多,同時(shí)基于其在術(shù)中、麻醉后恢復(fù)室(PostanesthesiaCareUnit,PACU)、以及危重病房(IntensiveCareUnit,ICU)的應(yīng)用提示了丙泊酚與臨床聯(lián)系的密切性,是理想的麻醉學(xué)藥物研究的代表。進(jìn)一步研究丙泊酚的應(yīng)用與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及內(nèi)部相關(guān)的分子機(jī)制具有重要的代表意義,亦是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。首先丙泊酚和腫瘤學(xué)的相關(guān)性研究可為麻醉學(xué)與腫瘤學(xué)探討提供方法依據(jù)、積累理論數(shù)據(jù)、從而推動(dòng)麻醉學(xué)與腫瘤學(xué)科的交叉研究;其次,對(duì)腫瘤患者術(shù)中麻醉用藥、術(shù)后ICU鎮(zhèn)靜用藥,尤其對(duì)合并有腫瘤的危重患者呼吸機(jī)治療下鎮(zhèn)靜用藥有重要的指導(dǎo)作用;同時(shí),對(duì)于由于種種原因需要主動(dòng)或者被動(dòng)長(zhǎng)期應(yīng)用丙泊酚的患者,丙泊酚與腫瘤進(jìn)展關(guān)系及相關(guān)分子機(jī)制的研究對(duì)于麻醉醫(yī)生判斷疾病發(fā)展、參與麻醉診療提供參考。體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及已知的初步數(shù)據(jù)及相關(guān)結(jié)論證明丙泊酚對(duì)于腫瘤細(xì)胞的活性有著重要影響,但是該影響的性質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的類型及分化程度關(guān)系密切,對(duì)不同類型腫瘤的生物學(xué)活性影響可以完全不同,例如在對(duì)乳腺癌、膀胱癌及神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞增殖方面的觀察發(fā)現(xiàn),丙泊酚所發(fā)揮的作用完全相反[3-4],這種相互矛盾的影響使得進(jìn)一步的研究更為必要。另外,關(guān)于丙泊酚對(duì)于卵巢癌生物活性影響及內(nèi)部相關(guān)的分子機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本研究采用體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的方法,檢測(cè)丙泊酚對(duì)其活性行為的影響;同時(shí)通過(guò)測(cè)定丙泊酚應(yīng)用前后細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)分子表達(dá)及活性的變化從而確定丙泊酚影響卵巢癌細(xì)胞的分子機(jī)制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要,將實(shí)驗(yàn)對(duì)象隨機(jī)分為5組,包括正常培養(yǎng)對(duì)照組、脂肪乳組、低濃度丙泊酚組、及不同高濃度丙泊酚組。本研究?jī)?nèi)容共分三部分,第一部分將觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞的遷移、侵襲變化是否存在差異。所采用的實(shí)驗(yàn)方法:通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)觀察丙泊酚對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力的影響;通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)觀察丙泊酚對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響;而遷移、侵襲方面的觀察采用劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn);課題第二部分主要是探討丙泊酚對(duì)SKOV3細(xì)胞生物活性影響的相關(guān)分子機(jī)制,通過(guò)Westernblot技術(shù)檢測(cè)SKOV3各組細(xì)胞ERK1/2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況,同時(shí)通過(guò)微小RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)干擾技術(shù),觀察ERK1/2的表達(dá)水平與MMP-2/9的活性和表達(dá)是否存在關(guān)聯(lián),探討ERK1/2-MMP-2/9信號(hào)通路在丙泊酚對(duì)于卵巢腫瘤細(xì)胞生物行為的影響中是否扮演著極為重要的角色(圖32);課題第三部分探討丙泊酚對(duì)于其他與卵巢癌細(xì)胞惡性行為相關(guān)的重要分子,主要檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF、E-Cad的表達(dá)改變,進(jìn)一步探討丙泊酚/卵巢癌細(xì)胞相互作用可能存在的多種分子機(jī)制。采納Graphpadprism5.0軟件包對(duì)所檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,并且檢驗(yàn)水準(zhǔn)以α=0.05(雙側(cè))為標(biāo)準(zhǔn),而P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第一部分丙泊酚對(duì)卵巢癌SKOV3增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響目的探討丙泊酚對(duì)體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響方法對(duì)體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組:C組(對(duì)照組)、F組(脂肪乳組)、P25組為25μmol/L丙泊酚組)、P50組(50μmol/L丙泊酚組),P100組(100μmol/L丙泊酚組);采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在24h、48h、72h時(shí)的OD值,通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)觀察5組細(xì)胞在24h時(shí)的凋亡率,通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)觀察5組細(xì)胞在24h時(shí)的遷移、侵襲變化情況。結(jié)果1、CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:C組、F組、P25組、P50組、P100組在各時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)的OD值(450nm)差異有顯著性(F時(shí)間=1610,P<0.001;F濃度=180.5,P<0.001;F交互=4.0,P<0.001),其中C組、F組、P25組三組之間各時(shí)間點(diǎn)OD值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),P50組、P100組各時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)的OD值均高于F組、C組、P25組(P<0.001),P100組各時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)OD值均高于P50組(P<0.01)。。2、流式細(xì)胞技術(shù):實(shí)驗(yàn)設(shè)定的五組細(xì)胞在24h時(shí)的凋亡率存在差異,且差異有顯著性(F=277.60,P<0.001),其中C組、F組、P25組三組之間分別比較,在24h時(shí)的凋亡率均無(wú)差異(P>0.05),而P50組、P100組在24h時(shí)的凋亡率分別低于C組、F組、P25組(P<0.001),P100組在24h時(shí)的凋亡率低于P50組,但凋亡率差異無(wú)顯著性(P>0.05)。3、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果:C組、F組、P25組、P50組、P100組細(xì)胞在24h時(shí)的劃痕遷移率存在差異,且差異有顯著性(F=664.3,P<0.001),其中C組、F組、P25組三組之間分別比較,在24h時(shí)的劃痕遷移率差異均無(wú)顯著性(P>0.05),P50組、P100組在24h時(shí)的細(xì)胞劃痕遷移率分別高于C組、F組、P25組進(jìn)行比較(P<0.001),P1oo組雖高于P50組,但是兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果:C組、F組、P25組、P50組、P100組細(xì)胞在24h時(shí)的細(xì)胞遷移數(shù)存在差異,且差異有顯著性(F=254.7,P<0.001),其中C組、F組、P25組三組之間分別比較,在24h的遷移數(shù)差異均無(wú)顯著性(P>0.05),P50組、P100組分別與C組、F組、P25組進(jìn)行對(duì)比,細(xì)胞遷移數(shù)增多(P<0.001),P100組在24h時(shí)的細(xì)胞遷移數(shù)多于P50組(P<0.05)。5、Transwell-matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:C組、F組、P25組、P50組、P100組細(xì)胞在24小時(shí)Transwell細(xì)胞侵襲數(shù)存在差異,且五組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=160.0,P<0.001),其中C組、F組、P25組三組之間分別比較,每?jī)山M細(xì)胞侵襲數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),P50組、P100組分別與C組、F組、P25組進(jìn)行對(duì)比,侵襲數(shù)均增多(P<0.001),P100組在24h時(shí)的細(xì)胞侵襲數(shù)多于P50組(P<0.05)。結(jié)論丙泊酚能夠增強(qiáng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖、抑制其凋亡,并且與丙泊酚的藥物濃度、以及作用時(shí)間有一定相關(guān)性;丙泊酚能夠增強(qiáng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移能力,且呈濃度相關(guān)性;低濃度丙泊酚對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、及遷移能力無(wú)影響。第二部分ERK1/2-MMP-2/9信號(hào)通路在丙泊酚促進(jìn)卵巢癌SKOV3增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移作用中的研究目的探討ERK1/2-MMP-2/9信號(hào)通路在丙泊酚促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究。方法通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)五組細(xì)胞ERK1/2、MMP-2、MMP-9表達(dá)變化情況,并且通過(guò)siRNA干擾技術(shù)觀察丙泊酚對(duì)ERK1/2-MMP-2/MMP-9信號(hào)通路的調(diào)控變化,探討丙泊酚干預(yù)下的作用機(jī)制。結(jié)果1、C組、F組、P25組、P50組、P100組細(xì)胞ERK1/2、MMP-2、MMP-9表達(dá)均存在差異,且五組之間差異均有顯著性(FERK1/2=226.31,P<0.001;FMMP-2=383.2,P<0.001;FMMP-9=215.1,P<0.001);在丙泊酚刺激SKOV310分鐘和30分鐘后,不同濃度的丙泊酚對(duì)于ERK1/2通路有激活作用,且差異有顯著性(F=568.9,P<0.001),10分鐘時(shí)高濃度組(P100組)增加了ERK1/2的磷酸化,30分鐘時(shí)P50組、P100組ERK1/2磷酸化更為明顯(P<0.01);2、C組、F組、P25組三組之間分別比較,ERK1/2、MMP-2、MMP-9表達(dá)差異均無(wú)顯著性,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);3、P50組、P100組ERK1/2、MMP-2、MMP-9表達(dá)均高于C組、F組、P25組(P<0.01);4、P100組ERK1/2表達(dá)高于P50組,且差異均有顯著性,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),P100組MMP-2、MMP-9的表達(dá)與P50組差異均無(wú)顯著性,均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);5、對(duì)于ERKsiRNA處理過(guò)的細(xì)胞,丙泊酚不能有效上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)(P>0.05),然而對(duì)于對(duì)照siRNA處理后的細(xì)胞,丙泊酚能夠升高M(jìn)MP-2及MMP-9的表達(dá)(P<0.05);6、ERKsiRNA處理過(guò)的各組細(xì)胞OD值存在差異,呈增高趨勢(shì)(F時(shí)間=44.8,P<0.01;F濃度=184.4,P<0.01;F交互=3.239,P<0.01);凋亡率呈降低趨勢(shì)(F=305.1,P<0.01);劃痕實(shí)驗(yàn)遷移率呈增高趨勢(shì)(F=239.1,P<0.001),Transwell遷移/侵襲數(shù)均呈增高趨勢(shì)(F=256.5,P<0.001;F=304.6,P<0.001)。結(jié)論1、丙泊酚能夠上調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞表達(dá)ERK1/2、MMP-2/9并且與丙泊酚的藥物濃度有一定相關(guān)性;2、丙泊酚能夠上調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞表達(dá)ERK1/2,并且通過(guò)ERK1/2促進(jìn)MMP-2及MMP-9的表達(dá)進(jìn)而影響SKOV3細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,ERK1/2siRNA的干預(yù)進(jìn)一步證實(shí)了丙泊酚引發(fā)的ERK1/2-MMP通路的存在;3、低濃度丙泊酚對(duì)卵巢癌SKOV3表達(dá)ERK1/2及MMP-2/9無(wú)影響;4、在ERKsiRNA干預(yù)下,丙泊酚對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲、遷移活性有影響作用。第三部分VEGF、E-cadehesion在丙泊酚促進(jìn)卵巢癌SKOV3增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用目的探討VEGF、E-cadehesion表達(dá)在丙泊酚促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移作用中的分子機(jī)制研究方法基于Westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù),檢測(cè)在丙泊酚干預(yù)下,各組SKOV3細(xì)胞表達(dá)VEGF、E-cadherin(TGFβ-1干預(yù)前后)的變化,探討丙泊酚對(duì)SKOV3生物學(xué)活性影響的可能機(jī)制。結(jié)果1、C組、F組、P25組、P50組、P10組細(xì)胞VEGF、E-cadherin(TGF-β1干預(yù)后)表