細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)

細(xì)胞生物學(xué)研討技術(shù)福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張健一細(xì)胞形狀構(gòu)造的察看方法〔一〕、光鏡技術(shù)1、幾種常見光學(xué)顯微鏡A普通光學(xué)顯微鏡普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成，即：①照明系統(tǒng)，包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體；③機(jī)械安裝，用于固定資料和察看方便?！直媛逝c放大倍數(shù)分辨率：指顯微鏡能分辨物體最小間隔的才干，分辨力的大小決議于光的波長和鏡口率以及介質(zhì)的折射率，用公式表示為：R=0.61λ/N．A．其中N．A．＝ｎsinα/2〔n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角；N.A.=鏡口率；λ＝入射光波長〕放大倍數(shù)＝物鏡倍數(shù)目鏡倍數(shù)＝N.A〔500－1000〕部分介質(zhì)的折射率介質(zhì) 空氣 水 香柏油α溴萘 折射率 1 1.331.515 1.66 普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值不會(huì)小于0.2μm。B暗視野顯微鏡運(yùn)用特殊的照明方法，使照明光線不直接進(jìn)入物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因此視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。運(yùn)用：察看未經(jīng)染色的活體或膠體粒子。C相差顯微鏡〔PCM〕1953年獲得諾貝爾物理獎(jiǎng)，相差顯微鏡的根本原理是，把透過標(biāo)本的可見光〔直射光和衍射光〕的光程差變成振幅差，從而提高了各種構(gòu)造間的對比度，使各種構(gòu)造變得明晰可見。運(yùn)用：察看未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。一種介殼蟲的染色體〔PCM照片〕D倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于察看培育的活細(xì)胞，具有相差物鏡。E熒光顯微鏡細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但假設(shè)用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)展定性和定量研討的工具之一。熒光顯微鏡照片〔微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色〕F微分干涉差顯微鏡〔DIC顯微鏡〕能顯示細(xì)胞構(gòu)造的三維立體投影影像，立體感強(qiáng)，用于研討活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，與錄像設(shè)備結(jié)合，可察看活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。尼康E800熒光DIC顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻G激光共聚焦掃描顯微鏡〔LSC顯微鏡〕可改動(dòng)察看的焦平面，因此能進(jìn)展“光學(xué)切片〞，察看較厚樣品的內(nèi)部構(gòu)造。將改動(dòng)焦點(diǎn)獲得的一系列細(xì)胞不同平面上的圖像疊加后，可重構(gòu)出樣品的三維構(gòu)造。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于察看細(xì)胞形狀，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形狀的丈量。LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管2光鏡標(biāo)本的制備以石蠟切片為例：資料處置固定脫水包埋切片染色察看染色劑：普通染色劑，熒光染色劑3光鏡技術(shù)的運(yùn)用A察看活細(xì)胞的形狀構(gòu)造，生命運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞周期。B細(xì)胞器的定位及功能研討。C基因產(chǎn)物與大分子物質(zhì)的定位及定量。D監(jiān)測細(xì)胞代謝活動(dòng)。例：胞內(nèi)鈣離子濃度的監(jiān)測鈣是通用的第三信使，能特異地選擇性地調(diào)理細(xì)胞的活動(dòng)，因此測定細(xì)胞中鈣離子濃度在空間和時(shí)間上的變化，對于監(jiān)控許多細(xì)胞的生理活動(dòng)有重要作用。如受精時(shí)，卵細(xì)胞忽然定位地將鈣離子釋放到胞漿中。鈣指示劑：FuRA－2，水母發(fā)光蛋白等沙元雙細(xì)胞胚中一個(gè)細(xì)胞的鈣信號(hào)引起鈣依賴水母發(fā)光蛋青絲光羅丹明123染色后顯示的細(xì)胞線粒體的定位〔二〕、電鏡技術(shù)1、透射電子顯微鏡〔TEM〕透射電子顯微鏡以電子束為光源，由于電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短，因此使其分辨力大大提高，目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。2掃描電子顯微鏡〔SEM〕掃描電子顯微鏡〔SEM〕，可用來察看標(biāo)本的外表構(gòu)造。其任務(wù)原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品外表激發(fā)出次級(jí)電子，次級(jí)電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的外表構(gòu)造有關(guān)，次級(jí)電子由探測體搜集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體籠統(tǒng)，反映了標(biāo)本的外表構(gòu)造。※SEM制片技術(shù)固定脫水及臨界點(diǎn)枯燥裝樣樣品包被察看固定：組織培育細(xì)胞戊二醛；大塊組織戊二醛＋四氧化鉺〔雞尾酒固定法〕包被：噴鍍金屬膜，使其在電子束的激發(fā)下，釋放次級(jí)電子。3掃描透射電子顯微鏡〔STEM〕是獨(dú)一不需求染色、固定而可以直接觀測單個(gè)生物分子的儀器。世界上僅有幾臺(tái)。4掃描隧道顯微鏡〔STM〕獲1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)?？捎脕盹@示晶體外表原子布陣。固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)三態(tài)物質(zhì)均可進(jìn)展察看，能直接察看生物大分子的原子布陣，也能察看一些生物構(gòu)造的原子陳列，有助于把生物學(xué)研討推進(jìn)到納米科學(xué)程度。5冷凍斷裂、冷凍蝕刻電鏡技術(shù)冰凍蝕刻亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進(jìn)展冰凍。然后用冷刀驟然將標(biāo)本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴顯露斷面構(gòu)造，稱為蝕刻。蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強(qiáng)反差和強(qiáng)度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)膜。復(fù)膜顯示出了標(biāo)本蝕刻面的形狀，在電鏡下得到的影像即代表標(biāo)本中細(xì)胞斷裂面處的構(gòu)造。二、生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)〔一〕、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)染色〔histochemicalorcytochemicalstaining〕是利用染色劑可同細(xì)胞的某種成分發(fā)生反響而著色的原理，對某種成分進(jìn)展定性或定位研討的技術(shù)。利用這種方法對細(xì)胞的各種成分幾乎都能顯示，包括有無機(jī)物、醛、蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、酶等?！捕?、免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)〔immunocytochemistry〕是根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專注結(jié)合，對抗原進(jìn)展定位測定的技術(shù)?？乖饕獮榇蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子；抗體那么是由漿細(xì)胞針對特定的抗原分泌的γ球蛋白。假設(shè)將抗體結(jié)合上標(biāo)志物，再與組織中的抗原發(fā)生反響，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位?！踩?、顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有本人特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長為260nm，而蛋白質(zhì)的那么為280nm。有的成分經(jīng)組織化學(xué)染色后，對可見光有特定的吸收光譜。根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計(jì)對某些成分進(jìn)展定位、定性，甚至定量測定?！菜摹?、放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù)〔radioautography；autoradiography〕用于研討標(biāo)志化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素〔如14C和3H〕標(biāo)志的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時(shí)間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處置顯示復(fù)原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)志物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)志上放射性的化合物進(jìn)展定位或相對定量測定?！参濉?、分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)〔molecularhybridization〕是在研討DNA分子復(fù)性變化根底上開展起來的一種技術(shù)。其原理是，具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，經(jīng)過氫鍵結(jié)合，構(gòu)成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間能否具有互補(bǔ)關(guān)系。三、細(xì)胞分別技術(shù)〔一〕、離心技術(shù)離心是研討如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子根本手段。普通以為，轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速超越25Kr/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機(jī)。目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)100Kr/min，離心力超越500Kg。1、差速離心

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分別不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器2、密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)構(gòu)成一延續(xù)或不延續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，經(jīng)過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分別。這類分別又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分別活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1〕能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；2〕PH中性或易調(diào)為中性；3〕濃度大時(shí)浸透壓不大；4〕對細(xì)胞無毒?！捕?、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)展快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞經(jīng)過高頻振蕩控制的噴嘴，構(gòu)成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處置，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分別純度可達(dá)99%?！踩?、細(xì)胞電泳在一定PH值下細(xì)胞外表帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種景象稱為細(xì)胞電泳〔cellelectrophoresis〕。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細(xì)胞或處于不同生理形狀的同種細(xì)胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動(dòng)速度不同。在恒定的電場條件下，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因此可經(jīng)過測定電泳速度來推算出細(xì)胞的ξ電位。ξ電位常因細(xì)胞生理形狀和病理形狀而異，因此在診斷疾病上有一定價(jià)值。此外由于不同類型的細(xì)胞在電場中的泳動(dòng)速度不同，細(xì)胞電泳尚可用來分別不同種類的細(xì)胞，例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開。四、細(xì)胞培育與細(xì)胞雜交高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研討單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)〔invivo〕的功能活動(dòng)