沉默NET-1基因課件

沉默NET-1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響

陳莉，王桂蘭，秦婧，吳園園，朱建偉南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellularcarcinomaHCC）是全球性的健康問(wèn)題之一。我們南通啟東是WHO確定的HCC高發(fā)研究現(xiàn)場(chǎng)。研究基于我們的首次發(fā)現(xiàn)NET-1在HCC組織中特定表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該基因參與HCC細(xì)胞的分裂增殖和癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程,探討針對(duì)NET-1的siRNA抑制肝癌癌細(xì)胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表達(dá)，及該基因?qū)Π┘?xì)胞增殖、遷移、內(nèi)吞的影響。一、項(xiàng)目研究背景NET-1與NET-2到NET-7一起統(tǒng)稱為NET-X，它們是由Serru等于2000年在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的7個(gè)新的含4次跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily或tetraspanfamily,簡(jiǎn)稱TM4SF)的成員。

NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1)

定位于染色體1p34.1上，其mRNA全長(zhǎng)為1297bp(基因庫(kù)登記號(hào)碼AF065388)，為TM4SF的成員之一，最近證實(shí)其為腫瘤相關(guān)基因。1、NET-1siRNA表達(dá)質(zhì)粒和myc-NET-1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。2、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染。3、細(xì)胞內(nèi)總RNA抽提及RT-QPCR檢測(cè)NET-1mRNA。4、Westernblot檢測(cè)NET-1蛋白表達(dá)。5、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。6、流式細(xì)胞儀(FCN)檢測(cè)各組細(xì)胞處于不同細(xì)胞周期中的比例與增殖指數(shù)。7、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞二圍空間的遷移能力。8、Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞三圍空間的遷移能力。9、Capture-ELISA方法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)生物素標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白水平。10、anti-uPAR標(biāo)記的癌細(xì)胞偽足形成實(shí)驗(yàn)。一、材料與方法

系統(tǒng)組織成人組織胎兒組織惡性組織第一組第二組第三組消化系統(tǒng)胃+NA*+

食道+NANA

小腸+NANA

結(jié)腸+NANA

直腸+NA+

胰腺－NA+

肝－－+泌尿生殖系統(tǒng)腎+++睪丸+++宮頸+NA(halan細(xì)胞l)+

宮體+NA+

前列腺+NANA

乳腺+NANA內(nèi)分泌系統(tǒng)垂體+NANA

甲狀腺+NANA

腎上腺+NANA淋巴造血系統(tǒng)造血細(xì)胞－NA－**

淋巴結(jié)+NANA

骨髓－NANA

脾臟+NANA

胸腺+NANA神經(jīng)系統(tǒng)腦++NA

脊髓+NANA

視網(wǎng)膜+NANA其他心－+黑色素瘤+肺++NA

肌肉++NA

皮膚++NA

胎盤+NANA

*NA:現(xiàn)在未做檢測(cè)；**白血病，淋巴瘤1.檢測(cè)人體組織中NET-1mRNA表達(dá)鎖定研究目標(biāo)——HCC二、結(jié)果M1234567891011LanesM:200ngof1kbsizeladder(NewEnglandBioLabs);Lanes1-3:NormalFetalLiverTissues;Lanes4-7:NormalAdultLiverTissues;Lanes8-11:LiverCancerTissues

轉(zhuǎn)染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721細(xì)胞中NET-1mRNA的表達(dá)（RT-QPCR）以未處理組為1。NET-1-siRNA組和myc-NET-1組分別與未處理組相比(●P<0.05，●●p<0.01)；NET-1-siRNA組與pU6H1-GFP組相比(▲P<0.05，▲p<0.01)；myc-NET-1組與pcDNA3.1/myc組相比(★P<0.05，★★p<0.01)

2、RT-QPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染NET-1siRNA和myc-NET-1細(xì)胞中NET-1mRNA的結(jié)果

（2）NET-1-siRNA處理組細(xì)胞存在G0/G1和G2/M期阻滯，G0/G1和G2/M期細(xì)胞比例分別增加了17.04%和10.97%，S期細(xì)胞比例降低。NET-1穩(wěn)定表達(dá)組細(xì)胞更快地進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)程，G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低。GFPsiRNA組NET-1siRNA組對(duì)照組NET-1過(guò)表達(dá)組5.干擾NET-1可以抑制HCC細(xì)胞遷移在NET-1siRNA組中顯著減少(p<0.05)，在myc-NET-1組中明顯增加(p<0.05)。Mock組與未處理組間差異未見(jiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p>0.05）NET-1siRNA處理細(xì)胞后遷移能力明顯下降。轉(zhuǎn)染48h后穿過(guò)Matrigel膠細(xì)胞數(shù)NET-1siRNA組（21.42±5.74）和pU6H1-GFP（45.60±8.25）差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；myc-NET-1組（64.80±6.14）和pcDNA3.1/myc（38.20±7.22）差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

6.干擾NET-1可以抑制HCC細(xì)胞內(nèi)吞

轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tfn)內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)顯示，NET-1siRNA組癌細(xì)胞的內(nèi)吞能力明顯下降。其他組間的內(nèi)吞作用變化不明顯。未處理anti-NET-1兔IgGNET-1siRNAGFP-siRNA7.干擾NET-1可以抑制HCC細(xì)胞侵襲偽足形成NET-1siRNA處理細(xì)胞偽足形成細(xì)胞百分比明顯減少(p<0.01)

NET-1siRNA處理細(xì)胞中以anti-uPAR標(biāo)記的癌細(xì)胞偽足明顯減少。

8.干擾NET-1可以抑制裸鼠HCC的生長(zhǎng)myc-NET-1NET-1siRNA9.NET-1表達(dá)與HCC臨床病理因素和預(yù)后的研究(1)NET-1表達(dá)與HCC臨床病理因素密切相關(guān)。NET-1基因蛋白表達(dá)與HCC臨床病理因素的關(guān)系(76例)（2）Kaplan-Meier生存曲線

（3）Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素生存分析HCC轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表達(dá)均具有獨(dú)立的預(yù)后意義。風(fēng)險(xiǎn)分析提示這些因素增強(qiáng)時(shí)均能增加HCC病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)(其風(fēng)險(xiǎn)比均＞1)三、討論

本文通過(guò)構(gòu)建NET-1siRNA和myc-NET-1表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC-7721。研究發(fā)現(xiàn)NET-1基因參與肝癌細(xì)胞的增殖分裂活動(dòng)，干擾肝癌細(xì)胞NET-1基因的表達(dá)，可以抑制癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)受限，可以抑制細(xì)胞在二圍、三圍空間的遷移能力、癌細(xì)胞內(nèi)吞能力和侵襲性偽足形成能力。相反，增加NET-1基因的表達(dá)，癌細(xì)胞表現(xiàn)為顯著增生，更快地進(jìn)入細(xì)胞周期，遷移能力提高。研究結(jié)果揭示了肝癌細(xì)胞中NET-1基因的功能