第5章分子發(fā)光分析法課件

第5章

分子發(fā)光分析法一、分子熒光與磷光產(chǎn)生過程luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二、激發(fā)光譜與熒光光譜excitationspectrumandfluore-scencespectrum三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)關(guān)系

relationbetween

fluorescenceandmolecularstructure四、影響熒光強(qiáng)度的因素factorinfluenced

fluorescence五、熒光(磷光)光譜儀fluorescence/phosphorescencespectrophotometer2024/1/6第一節(jié)

分子熒光與磷光molecular

luminescence

analysis

molecularfluorescenceandphosphorescence一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程

luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence2024/1/6

從分子結(jié)構(gòu)理論，討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1.分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；2024/1/6S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫2.電子激發(fā)態(tài)的多重度2024/1/6

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)（Pauli不相容原理）；S0→S1、S2允許躍遷；S0→T1

禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率?。?.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑2024/1/6

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和非輻射躍遷等方式失去能量（去活化）；去活化輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫非輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；熒光：10-7～10-9

s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；磷光：10-4～10s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)；（1）非輻射能量傳遞過程（非輻射躍遷）2024/1/6

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12

s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重度等能級(jí)間的無輻射能級(jí)交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的振動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷。但若重疊程度較大時(shí)，可通過自旋—軌道耦合等作用完成系間跨越。二、激發(fā)光譜與熒(磷)光光譜（發(fā)射光譜）

excitationspectrumandfluore-scencespectrum2024/1/6熒光(磷光)：光致發(fā)光，激發(fā)光波長怎樣選擇？1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

選最大發(fā)射波長為測(cè)量波長，改變激發(fā)光的波長，測(cè)量熒光(磷光)強(qiáng)度的變化。化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)系曲線（圖中曲線I）。

激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.熒光光譜(或磷光光譜)2024/1/6將激發(fā)光波長固定在最大激發(fā)波長處,然后掃描發(fā)射波長，測(cè)定不同發(fā)射波長處的熒光(或磷光）強(qiáng)度(圖中曲線II或III)。2024/1/63.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系2024/1/6

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量(如能級(jí)圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。2024/1/6200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

（實(shí)際上只有很少的有機(jī)分子能發(fā)射熒光）2024/1/61.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)（與激發(fā)光頻率相適應(yīng)），才能吸收；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（

）：

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)若用數(shù)學(xué)式來表達(dá)這些關(guān)系，得到

=kf

/（kf+

ki）式中kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，

ki為其它有關(guān)過程的速率常數(shù)的總和。

凡是能使kf

值升高而使其它ki值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。實(shí)際上，對(duì)于高熒光分子，例如熒光素，其量子產(chǎn)率在某些情況下接近1，說明

ki很小，可以忽略不計(jì)。一般來說，kf主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而

ki則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

什么樣的結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生熒光？它們之間的關(guān)系如何？2024/1/62.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光2024/1/6（1）躍遷類型：*→躍遷的熒光效率較高，這是由于

躍遷比n

具有更大的摩爾吸光系數(shù)，且*→比

n躍遷的壽命更短，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上供電子基團(tuán)增強(qiáng)熒光（如-OH，-OR，－NH2，－CN，－NR2等）。吸電子基團(tuán)（－COOH、－C＝O、－NO2、鹵素等）則減弱熒光2024/1/6內(nèi)部重原子效應(yīng)、外部重原子效應(yīng)四、影響熒光強(qiáng)度的因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure2024/1/6

影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光強(qiáng)度下降。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象2024/1/6

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光的物質(zhì)。如色胺酸中的重鉻酸鉀；5.溶液熒光的猝滅（P95）2024/1/6

熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)稱為猝滅劑。導(dǎo)致熒光猝滅的主要類型：①

碰撞猝滅（主要類型之一）碰撞猝滅是指處于激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞，使激發(fā)單重態(tài)的熒光分子以無輻射躍遷的方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用。②靜態(tài)猝滅（組成化合物的猝滅）

由于部分熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子生成非熒光的配合物而產(chǎn)生的。此過程往往還會(huì)引起溶液吸收光譜的改變。③轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅分子由于系間的跨越躍遷，由單重態(tài)躍遷到三重態(tài)。轉(zhuǎn)入三重態(tài)的分子不發(fā)射熒光而使熒光猝滅。溶液中的溶解氧可對(duì)有機(jī)化合物的熒光產(chǎn)生猝滅效應(yīng)。2024/1/6④發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅某些猝滅劑分子（如Fe2＋）與熒光物質(zhì)分子（如甲基藍(lán)）發(fā)生了電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)，使其熒光猝滅。⑤熒光物質(zhì)的自猝滅在濃度較高的熒光物質(zhì)溶液中，單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自猝滅。有些熒光物質(zhì)分子在溶液濃度較高時(shí)會(huì)形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強(qiáng)度的降低或消失。2024/1/6五、熒光光譜儀2024/1/6

測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器；檢測(cè)器與激發(fā)光方向成直角。

基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長的第二單色器；光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見紫外區(qū))檢測(cè)器：光電倍增管等。儀

器

光

路

圖2024/1/6磷光檢測(cè)（磷光光譜儀）2024/1/6熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量?？稍谟袩晒獍l(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。測(cè)量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源(即時(shí)間分辨技術(shù))。室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。六、分子熒光分析法及其應(yīng)用2024/1/61.特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)下限：0.1～0.001g/ml

（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜來鑒定物質(zhì)；（3）試樣量少、方法簡便（4）提供較多的物理參數(shù)

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。2.定量依據(jù)與方法2024/1/6(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光強(qiáng)Ia和熒光量子效率

：

If=

Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-

lc)If=

I0(1-10-

lc)=

I0(1-e-2.3

lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3

I0

lc

=Kc即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中（A＝

lc0.05）才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。（2）定量方法2024/1/6標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：

在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，列比例計(jì)算即可。3.熒光分析法的應(yīng)用2024/1/6(1)無機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑形成配合物后測(cè)量，可測(cè)量20多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定(2)生物與有機(jī)化合物的分析主要為具有共軛體系的芳香族化合物，見表。2024/1/64、磷光分析法的應(yīng)用2024/1/61.稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳