噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介課件

噬菌體展示技術(shù)及其

通用實驗技術(shù)簡介報告人：王東方噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介噬菌體展示Phagedisplay噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介1.什么是噬菌體展示技術(shù)？

噬菌體展示技術(shù)(PhageDisplayTechniques,PDT)是一項篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。使大量多肽與其DNA編碼序列之間、表型與基因型之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細胞表面受體等）的多肽配體通過淘選得以快速鑒定。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介1.1噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入

絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介1985第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù)；展示多肽SmithGP.Science.1985;228:1315-71988噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990抗體片段的展示1993展示cDNA文庫1994/1995研發(fā)了‘phagetwo-hybrid’技術(shù)1996首次體內(nèi)invivo淘選試驗1998噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001Automatedphagedisplayselection噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介2.噬菌體展示技術(shù)的原理噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介外源多肽或蛋白質(zhì)表達在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過噬菌體DNA序列測序出來，使得表達蛋白（表現(xiàn)型）和編碼基因（基因型）之間完美地結(jié)合起來，為生物科學提供高效而實用的研究手段。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.常用的噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.1噬菌體結(jié)構(gòu)

圖1.噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.2噬菌體的分類因為噬菌體主要由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成，所以，可以根據(jù)蛋白質(zhì)外殼或核酸的結(jié)構(gòu)特點對噬菌體進行分類。根據(jù)噬菌體蛋白結(jié)構(gòu)可分為：

無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體

線狀體噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介按照噬菌體的核酸類型分類可分為：

ssRNA：噬菌體中所含的核酸是單鏈RNA。

dsRNA：噬菌體中所含的核酸是雙鏈RNA。

ssDNA：噬菌體中所含的核酸是單鏈DNA。

dsDNA：噬菌體中所含的核酸是雙鏈DNA。

噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.3噬菌體侵染細菌

噬菌機理噬菌體顆粒感染一個細菌細胞后可迅速生成幾百個子代噬菌體顆粒，每個子代顆粒又可感染細菌細胞，再生成幾百個子代噬菌體顆粒。如此重復只需4次，一個噬菌體顆粒便可使幾十億個細菌感染而死亡。噬菌體除了能使宿主細菌裂解死亡外，還有一些噬菌體感染細菌后，并不使細胞死亡，稱為溫和噬菌體，這些噬菌體感染細菌后，將其自身的基因組整合進宿主細胞的基因組，此時，這種宿主細菌稱為溶原性細菌。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.3噬菌體侵染大腸桿菌噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

3.4λ噬菌體展示系統(tǒng)（1）PV展示系統(tǒng)。λ噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分。PV有兩個折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。λ噬菌體的裝配在細胞內(nèi)進行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。（2）D蛋白展示系統(tǒng)。D蛋白的參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。當突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。該系統(tǒng)有一個很好的特點，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時特別有用。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.5T4噬菌體展示系統(tǒng)

T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀90年代中期建立起來的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實上，在DNA包裝被抑制時，T4是雙鏈DNA噬菌體中唯一能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.6單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)絲狀噬菌體是一個能夠感染革蘭氏陰性細菌的病毒大家族，他們都含有單鏈DNA基因組，都包裝于由含有幾千拷貝的主要衣殼蛋白（PⅧ）和位于頂端的次要衣殼蛋白（PⅢ）所組成的少許柔韌性的管狀衣殼中。M13和Fd噬菌體均是絲狀噬菌體。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介M13噬菌體遺傳圖譜和結(jié)構(gòu)示意圖3.6.1M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

次要衣殼蛋白PⅢPⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸桿菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個～5個拷貝PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT3個功能區(qū)域，這3個功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸桿菌菌毛及穿透細胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。

3.6.2次要衣殼蛋白PⅢ展示系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

PⅢ展示系統(tǒng)，PⅢ有2個位點可供外源序列插入，當外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號肽(SgⅢ)和N1之間時，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即所謂“單價”噬菌體。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

3.6.3主要衣殼蛋白PⅧ展示系統(tǒng)

PⅧ展示系統(tǒng)。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，每個病毒顆粒有2700個左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數(shù)，此時可融合多肽甚至抗體片段。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介3.6.4噬菌粒載體和輔助噬菌體

噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質(zhì)粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。噬菌體的特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒有其它噬菌體基因；有質(zhì)粒復制起點(322ori)和噬菌體復制起點（Ffori用于合成ssDNA)；有包裝序列信號；有供篩選的抗生素標記基因；噬菌粒載體可以方便克隆，提高遺傳的穩(wěn)定性。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介相比噬菌體載體噬菌粒具有以下優(yōu)點：1.雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征；2.免除了將外緣DNA片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一繁瑣又費時的步驟；3.由于載體足夠小，故可得到長達10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介pCANTAB5e噬菌體質(zhì)粒圖譜噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介輔助噬菌體可以提供噬菌粒復制、合成ssDNA和病毒包裝所需的所有蛋白和酶。能夠幫助噬菌體載體在大腸桿菌體內(nèi)包裝復制。比如M13KO7輔助噬菌體。

M13KO7輔助噬菌體是由M13噬菌體改造而來，在M13復制起點插入了卡那霉素抗性基因用于篩選。能夠在唔噬菌體質(zhì)粒的情況下復制當有噬菌體質(zhì)粒時，由于噬菌體質(zhì)粒含有野生型M13或者是f1復制起點，因此，單鏈噬菌體質(zhì)粒的DNA會被優(yōu)先包裝并分泌。

噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介噬菌粒在輔助噬菌體的幫助下在大腸桿菌體內(nèi)完成組裝噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介4.單鏈絲狀噬體展示在重組抗體制備中的應(yīng)用

噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用：1.抗原表位分析2.制備特異性抗體3.制備疫苗，多價疫苗4.構(gòu)建新型生物催化劑（Renetal在1997年將T4DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達的融合蛋白能夠高效的連接粘性或是平末端。這就有可能吧催化某一代謝途徑的多種酶展示于噬菌體上，制造出人工的多酶復合體，或者把眾多的酶分子的活性位點展示到同一個噬菌體顆粒上，制作出superenzyme）噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介4.1單鏈絲狀噬菌體展示在鼠源重組抗體制備中的應(yīng)用抗體制備時噬菌體展示技術(shù)的重要應(yīng)用之一，噬菌體展示技術(shù)可以用來從天然抗體文庫中篩選特定的抗體，也可以用于人源或是鼠源免疫抗體文庫的的抗體篩選制備?，F(xiàn)在以鼠源單鏈重組抗體的制備為例，簡述一下噬菌體展示技術(shù)在抗體制備中的作用和方法。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

噬菌體抗體文庫的構(gòu)建類型主要有三種：天然抗體文庫，免疫文庫，合成抗體文庫。在殘留分析領(lǐng)域最為實用的技術(shù)是免疫抗體文庫。免疫抗體文庫在免疫過程中經(jīng)歷了一個親和突變的過程，因此從免疫抗體文庫中篩選出來的抗體具有更高的親和力和特異性。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

抗體（Ab）指機體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。借助于基因工程技術(shù)，既可以對完整抗體，又可以對抗體片段進行改造。其中小分子抗體因其分子量小、穿透性強、抗原性低、可在原核系統(tǒng)中表達及易于對其進行基因工程操作等優(yōu)點而受到研究者的重視，并成為基因工程抗體的研究熱點。常見的單價小分子抗體有scFv、Fab、Fv等。其中scFv小分子抗體具有抗體抗原識別的全部位點，而且分子量小，穩(wěn)定，易于表達的優(yōu)點被廣泛的采用，現(xiàn)以scFv單鏈重組抗體為例做簡述。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介4.2scFv單鏈重組抗體的制備噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介scFv重組基因的構(gòu)建噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介scFv基因與噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e連接噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

重組后的噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進宿主細胞，并在輔助噬菌體的幫助下在宿主體內(nèi)完成組裝，復制，增值的過程。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介融合蛋白的表達是低價的，只有不到10％的噬菌體可以表達融合基因，其余噬菌體展示的均是野生型噬菌體的p3蛋白，所以想要獲得親和高特異性好的噬菌體文庫需要進行多輪的淘篩來進行篩選。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介淘篩—親和淘篩噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介經(jīng)過多輪淘篩之后獲得親和性高特異性好的噬菌體，然后擴增保種，表達svFv基因，獲得抗體蛋白，然后抗體蛋白經(jīng)過純化定量之后，就可用于下一步的殘留檢測。噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介5.噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用與展望

噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介1、抗體制備

抗狂犬病毒的單鏈抗體，抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此抗體可專一性殺死被HIV-1感染并表達有g(shù)p120的淋巴細胞,中和響尾蛇毒素的單鏈抗體，等等。2、疫苗展示在噬菌體表面的HIV-1的gp120-V3環(huán)可象天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答,等等。3.

多肽類藥物如一些激動劑或拮抗劑從多肽庫中分離鑒定出來；已獲得一13肽，它能中和蛇毒α-bungarotoxin；從CX7C多肽庫中掏選到一個多肽能與Hantavirus結(jié)合，并使該病毒不能結(jié)合或感染細胞。人血管促生素（angiogenin）是一種能促進腫瘤血管生長的蛋白，用這個蛋白去淘選一個噬菌體展示多肽庫，所獲得的一個環(huán)狀8肽能與血管促生素結(jié)合，并能阻遏血管促生素噬菌體展示技術(shù)和其通用實驗技術(shù)簡介

4、腫瘤藥物導航載體用腫瘤細胞特殊的受體蛋白從展示文庫中淘選到的多肽或單鏈抗體，可以作為抗癌藥物的定向輸送工具。5、信息傳遞研究

利用噬菌體展示多肽庫，發(fā)現(xiàn)了一些受體，如凝血致活酶、黑皮質(zhì)素受體、CD80和一個Hantaviral受體；受體的