噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介課件

噬菌體展示技術(shù)及其

通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介報(bào)告人：王東方噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介噬菌體展示Phagedisplay噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介1.什么是噬菌體展示技術(shù)？

噬菌體展示技術(shù)(PhageDisplayTechniques,PDT)是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。使大量多肽與其DNA編碼序列之間、表型與基因型之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過(guò)淘選得以快速鑒定。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介1.1噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展Smith在1985年首次證實(shí)外源DNA可以插入

絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介1985第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù)；展示多肽SmithGP.Science.1985;228:1315-71988噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990抗體片段的展示1993展示cDNA文庫(kù)1994/1995研發(fā)了‘phagetwo-hybrid’技術(shù)1996首次體內(nèi)invivo淘選試驗(yàn)1998噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999Combinationofphagedisplaywithhigh-densityarrays2001Automatedphagedisplayselection噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介2.噬菌體展示技術(shù)的原理噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫(kù)與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過(guò)一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競(jìng)爭(zhēng)受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過(guò)3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過(guò)噬菌體DNA序列測(cè)序出來(lái)，使得表達(dá)蛋白（表現(xiàn)型）和編碼基因（基因型）之間完美地結(jié)合起來(lái)，為生物科學(xué)提供高效而實(shí)用的研究手段。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.常用的噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.1噬菌體結(jié)構(gòu)

圖1.噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.2噬菌體的分類因?yàn)槭删w主要由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成，所以，可以根據(jù)蛋白質(zhì)外殼或核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)噬菌體進(jìn)行分類。根據(jù)噬菌體蛋白結(jié)構(gòu)可分為：

無(wú)尾部結(jié)構(gòu)的二十面體有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體

線狀體噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介按照噬菌體的核酸類型分類可分為：

ssRNA：噬菌體中所含的核酸是單鏈RNA。

dsRNA：噬菌體中所含的核酸是雙鏈RNA。

ssDNA：噬菌體中所含的核酸是單鏈DNA。

dsDNA：噬菌體中所含的核酸是雙鏈DNA。

噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.3噬菌體侵染細(xì)菌

噬菌機(jī)理噬菌體顆粒感染一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞后可迅速生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒，每個(gè)子代顆粒又可感染細(xì)菌細(xì)胞，再生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒。如此重復(fù)只需4次，一個(gè)噬菌體顆粒便可使幾十億個(gè)細(xì)菌感染而死亡。噬菌體除了能使宿主細(xì)菌裂解死亡外，還有一些噬菌體感染細(xì)菌后，并不使細(xì)胞死亡，稱為溫和噬菌體，這些噬菌體感染細(xì)菌后，將其自身的基因組整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，此時(shí)，這種宿主細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.3噬菌體侵染大腸桿菌噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

3.4λ噬菌體展示系統(tǒng)（1）PV展示系統(tǒng)。λ噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。（2）D蛋白展示系統(tǒng)。D蛋白的參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí)，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn)，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對(duì)于展示那些可以對(duì)噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.5T4噬菌體展示系統(tǒng)

T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期建立起來(lái)的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過(guò)分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實(shí)上，在DNA包裝被抑制時(shí)，T4是雙鏈DNA噬菌體中唯一能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時(shí)組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時(shí)，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.6單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)絲狀噬菌體是一個(gè)能夠感染革蘭氏陰性細(xì)菌的病毒大家族，他們都含有單鏈DNA基因組，都包裝于由含有幾千拷貝的主要衣殼蛋白（PⅧ）和位于頂端的次要衣殼蛋白（PⅢ）所組成的少許柔韌性的管狀衣殼中。M13和Fd噬菌體均是絲狀噬菌體。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介M13噬菌體遺傳圖譜和結(jié)構(gòu)示意圖3.6.1M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

次要衣殼蛋白PⅢPⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸桿菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)～5個(gè)拷貝PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT3個(gè)功能區(qū)域，這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸桿菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。

3.6.2次要衣殼蛋白PⅢ展示系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

PⅢ展示系統(tǒng)，PⅢ有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號(hào)肽(SgⅢ)和N1之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整PⅢ蛋白來(lái)提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

3.6.3主要衣殼蛋白PⅧ展示系統(tǒng)

PⅧ展示系統(tǒng)。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，每個(gè)病毒顆粒有2700個(gè)左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長(zhǎng)的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介3.6.4噬菌粒載體和輔助噬菌體

噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。噬菌體的特征：攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒(méi)有其它噬菌體基因；有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(322ori)和噬菌體復(fù)制起點(diǎn)（Ffori用于合成ssDNA)；有包裝序列信號(hào)；有供篩選的抗生素標(biāo)記基因；噬菌粒載體可以方便克隆，提高遺傳的穩(wěn)定性。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介相比噬菌體載體噬菌粒具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)，具有常規(guī)質(zhì)粒的特征；2.免除了將外緣DNA片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一繁瑣又費(fèi)時(shí)的步驟；3.由于載體足夠小，故可得到長(zhǎng)達(dá)10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介pCANTAB5e噬菌體質(zhì)粒圖譜噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介輔助噬菌體可以提供噬菌粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需的所有蛋白和酶。能夠幫助噬菌體載體在大腸桿菌體內(nèi)包裝復(fù)制。比如M13KO7輔助噬菌體。

M13KO7輔助噬菌體是由M13噬菌體改造而來(lái)，在M13復(fù)制起點(diǎn)插入了卡那霉素抗性基因用于篩選。能夠在唔噬菌體質(zhì)粒的情況下復(fù)制當(dāng)有噬菌體質(zhì)粒時(shí)，由于噬菌體質(zhì)粒含有野生型M13或者是f1復(fù)制起點(diǎn)，因此，單鏈?zhǔn)删w質(zhì)粒的DNA會(huì)被優(yōu)先包裝并分泌。

噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介噬菌粒在輔助噬菌體的幫助下在大腸桿菌體內(nèi)完成組裝噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介4.單鏈絲狀噬體展示在重組抗體制備中的應(yīng)用

噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用：1.抗原表位分析2.制備特異性抗體3.制備疫苗，多價(jià)疫苗4.構(gòu)建新型生物催化劑（Renetal在1997年將T4DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效的連接粘性或是平末端。這就有可能吧催化某一代謝途徑的多種酶展示于噬菌體上，制造出人工的多酶復(fù)合體，或者把眾多的酶分子的活性位點(diǎn)展示到同一個(gè)噬菌體顆粒上，制作出superenzyme）噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介4.1單鏈絲狀噬菌體展示在鼠源重組抗體制備中的應(yīng)用抗體制備時(shí)噬菌體展示技術(shù)的重要應(yīng)用之一，噬菌體展示技術(shù)可以用來(lái)從天然抗體文庫(kù)中篩選特定的抗體，也可以用于人源或是鼠源免疫抗體文庫(kù)的的抗體篩選制備。現(xiàn)在以鼠源單鏈重組抗體的制備為例，簡(jiǎn)述一下噬菌體展示技術(shù)在抗體制備中的作用和方法。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

噬菌體抗體文庫(kù)的構(gòu)建類型主要有三種：天然抗體文庫(kù)，免疫文庫(kù)，合成抗體文庫(kù)。在殘留分析領(lǐng)域最為實(shí)用的技術(shù)是免疫抗體文庫(kù)。免疫抗體文庫(kù)在免疫過(guò)程中經(jīng)歷了一個(gè)親和突變的過(guò)程，因此從免疫抗體文庫(kù)中篩選出來(lái)的抗體具有更高的親和力和特異性。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

抗體（Ab）指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。借助于基因工程技術(shù)，既可以對(duì)完整抗體，又可以對(duì)抗體片段進(jìn)行改造。其中小分子抗體因其分子量小、穿透性強(qiáng)、抗原性低、可在原核系統(tǒng)中表達(dá)及易于對(duì)其進(jìn)行基因工程操作等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者的重視，并成為基因工程抗體的研究熱點(diǎn)。常見(jiàn)的單價(jià)小分子抗體有scFv、Fab、Fv等。其中scFv小分子抗體具有抗體抗原識(shí)別的全部位點(diǎn)，而且分子量小，穩(wěn)定，易于表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)被廣泛的采用，現(xiàn)以scFv單鏈重組抗體為例做簡(jiǎn)述。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介4.2scFv單鏈重組抗體的制備噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介scFv重組基因的構(gòu)建噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介scFv基因與噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e連接噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

重組后的噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞，并在輔助噬菌體的幫助下在宿主體內(nèi)完成組裝，復(fù)制，增值的過(guò)程。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介融合蛋白的表達(dá)是低價(jià)的，只有不到10％的噬菌體可以表達(dá)融合基因，其余噬菌體展示的均是野生型噬菌體的p3蛋白，所以想要獲得親和高特異性好的噬菌體文庫(kù)需要進(jìn)行多輪的淘篩來(lái)進(jìn)行篩選。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介淘篩—親和淘篩噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介經(jīng)過(guò)多輪淘篩之后獲得親和性高特異性好的噬菌體，然后擴(kuò)增保種，表達(dá)svFv基因，獲得抗體蛋白，然后抗體蛋白經(jīng)過(guò)純化定量之后，就可用于下一步的殘留檢測(cè)。噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介5.噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用與展望

噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介1、抗體制備

抗狂犬病毒的單鏈抗體，抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體，此抗體可專一性殺死被HIV-1感染并表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞,中和響尾蛇毒素的單鏈抗體，等等。2、疫苗展示在噬菌體表面的HIV-1的gp120-V3環(huán)可象天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答,等等。3.

多肽類藥物如一些激動(dòng)劑或拮抗劑從多肽庫(kù)中分離鑒定出來(lái)；已獲得一13肽，它能中和蛇毒α-bungarotoxin；從CX7C多肽庫(kù)中掏選到一個(gè)多肽能與Hantavirus結(jié)合，并使該病毒不能結(jié)合或感染細(xì)胞。人血管促生素（angiogenin）是一種能促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)的蛋白，用這個(gè)蛋白去淘選一個(gè)噬菌體展示多肽庫(kù)，所獲得的一個(gè)環(huán)狀8肽能與血管促生素結(jié)合，并能阻遏血管促生素噬菌體展示技術(shù)和其通用實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介

4、腫瘤藥物導(dǎo)航載體用腫瘤細(xì)胞特殊的受體蛋白從展示文庫(kù)中淘選到的多肽或單鏈抗體，可以作為抗癌藥物的定向輸送工具。5、信息傳遞研究

利用噬菌體展示多肽庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了一些受體，如凝血致活酶、黑皮質(zhì)素受體、CD80和一個(gè)Hantaviral受體；受體的