2024凝膠過(guò)濾層析結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血清中游離甲狀腺激素

2024凝膠過(guò)濾層析結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法基于凝膠過(guò)濾層析(GFC)進(jìn)行前處理，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)建立了血清中游離三碘甲腺原氨酸(FT3)和游離甲狀腺5,批內(nèi)及批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～10%,準(zhǔn)確度為85.4%~110%,基質(zhì)效應(yīng)為85.8%～114%,回收率為85.8%～107%。采用該方法與平衡透析法(ED)同時(shí)檢測(cè)了95份血清樣本，使用IBMSPSS生風(fēng)險(xiǎn)。正常情況下，T3、T4分別約99.7%和99.97%與特異的血漿蛋白相結(jié)合，僅有0.3%和0.03%為游離狀態(tài)，簡(jiǎn)稱為FT3和FT4。量樣本檢測(cè)，使其適用于臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。在此基礎(chǔ)上，基于1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器與裝置公司);PCWJ-10超純水機(jī)(成都品成科技有限公司);渦旋混勻儀(金壇區(qū)白塔新寶儀器廠);QB-800296孔板混勻儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);BT25S型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)(深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司);FiveEasyPlusFE28pH計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);平衡透析裝置(北京匯智和源生物技術(shù)有限公司)。甲醇、甲酸(色譜純，美國(guó)Fisher公司);超純水(杭州娃哈哈公司);氫氧化鈉(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司);磷酸二氫鈉二水合物和三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);無(wú)水磷酸氫二鈉(分析純，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司);Proclin300抑菌劑、羥乙基淀粉和牛血清白蛋白(上海源葉科技有限公司);表面活性劑TritonX-100(上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司);納他霉素(上海麥克林生化科技有限公司);氯化鈉(成都市科龍化工試劑廠);SephadexLH-2096孔過(guò)濾板、96孔提取板、96孔收集板、96孔進(jìn)樣板(納譜分析技術(shù)(蘇州)有限公司)。T3標(biāo)準(zhǔn)品(98%,批號(hào)：21A043-C3,上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司);T4標(biāo)準(zhǔn)品(98%,批號(hào)：21A034-F6,上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司);T3內(nèi)標(biāo)(T3-13C12,同位素豐度為99.3%,純度為94.2%,同位素豐度≥99%,純度≥98%,批號(hào)：22T021-T2,上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司)。血清樣品均來(lái)自淄博市中醫(yī)醫(yī)院的剩余樣本，分別準(zhǔn)確稱取T3、T4標(biāo)準(zhǔn)品各10.0mg,用5%氨水-甲醇溶解，并定容于10mL棕色容量瓶，分別配制得到質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的T3、T4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用30%甲醇水稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制得到質(zhì)量濃度分別為2、4、10、20、50、100、150、200pg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液用30%甲醇水稀釋，配制得到T3-13C12、T4-13C6質(zhì)量濃度均為200pg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。白蛋白，攪拌至完全在純水中溶解后，使用超純水稀釋至100mL。制得到低、中、高質(zhì)量濃度(分別為10、50、150pg/mL)的質(zhì)控2mL超純水進(jìn)行活化，再用4mL磷酸鹽緩沖液(PB,0.1mol/L,定方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；脫溶劑氣溫度：600℃;加熱塊溫度：400℃;接口電壓：4.0kV;霧化氣流速：3.0L/min;干將T3、T4、T3-13C12、T4-13C6標(biāo)準(zhǔn)溶777.4、663.7、783.5。根據(jù)前體離子進(jìn)行產(chǎn)分別考察了純水、甲酸水(0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0.005%、甲酸+2mmol/L乙酸銨-水溶液作為流動(dòng)相A,甲醇、乙腈、50%甲醇-乙腈、0.1%甲酸+2mmol/L乙酸銨-甲醇溶液作為流動(dòng)相B時(shí)待測(cè)物的響應(yīng)強(qiáng)度，最終選擇0.002%甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。和T4具有良好的分離效果(見圖1)。NminNmin化、平衡、上樣、淋洗(1~8管，用緩沖液洗去蛋白結(jié)合態(tài))、洗脫(9~16管，用甲醇洗脫游離態(tài)),每管收集0.5mL,分別進(jìn)行檢測(cè)，示，根據(jù)結(jié)合態(tài)與游離態(tài)的分段情況，最終選用羥丙基葡聚糖凝膠進(jìn)一步考察了SephadexLH-20填料量分別為5、10、15、20、30、40、60、100、150mg時(shí)的分離效果。如圖2B所示，當(dāng)填料分別為0、0.5、1、1.5、2倍的影響，結(jié)果表明，隨著血清稀釋倍數(shù)淋洗液主要用于洗去結(jié)合蛋白，一般用水或緩沖液?？疾炝薚ris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH7.4)、PB緩沖液(0.1相近，考慮到溶液配制過(guò)程以及實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，最終選用淋洗液為Tris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH7.4)?？疾炝薚ris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH7.4)體積分別為2、4、6、8mL時(shí)的淋洗效果。如圖3B所示，當(dāng)填料量為15mg,上樣量個(gè)濃度水平測(cè)定3次。通過(guò)LabSolutionsVer.5.60軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處4~200pg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.999后進(jìn)行檢測(cè)。分別以信噪比S/N>3和S/N>10(LOD)和定量下限(LOQ),得到FT3、FT4的檢出限分別為1、2pg/mL,定量下限分別為2、4pg/mL。后，分別添加低、中、高濃度(10、50、150pg/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平平行制備3份，將上述樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)在85%~115%范圍時(shí)，的基質(zhì)效應(yīng)為85.8%~114%,說(shuō)明沒有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。計(jì)算得到FT3和FT4的回收率分別為85.8%~103%和89.7%~107%。內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。通過(guò)3個(gè)分析批連續(xù)三天進(jìn)行檢測(cè)，得到分別為3.4%～10%和1.8%~8.8%,批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度分別為85.4%~110%和89.1%~102%。使用IBMSPSSStatistics26和MedCalc統(tǒng)計(jì)軟件(v.20.0.0)測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t