蠶豆病鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課件

★年級、專業(yè)、班級：2021級臨床三、四大班★實(shí)驗(yàn)課時間：2021年4月18日★實(shí)驗(yàn)室：第二實(shí)驗(yàn)室★組別：第四組★組員：梁婧、和珍、李艷、張玲藝、解汐卓、成春梅、吳皎、楊紫燕、王驍、張慶昆★報(bào)告人：吳皎患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。體格檢查：體溫38℃，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞1.98×1012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5μmol/L，結(jié)合膽紅素13.7μmol/L，未結(jié)合膽紅素71.8μmol/L，尿蛋白〔++〕，潛血(+)，尿膽紅素(－)，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細(xì)胞。案例初步判斷患兒是何種疾??？紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶〔G6PD〕缺乏癥〔蠶豆病〕性別：男性年齡：3歲主要病癥：體溫38℃、面色蒼白、血尿1天、皮膚及鞏膜黃染、惡心、嘔吐

誘因：1天前食用新鮮蠶豆既往史：患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況·概念：G6PD缺乏癥是一種遺傳性溶血性疾病。發(fā)病率具有地方、民族差異性。發(fā)病機(jī)制：G6PD↓→NADPH+H+↓→GSH↓→紅細(xì)胞的抗氧化能力↓→發(fā)生溶血紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶〔G6PD〕缺乏癥正常紅細(xì)胞溶血性貧血紅細(xì)胞左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒〔黃疸〕左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒〔黃疸〕正常紅細(xì)胞溶血性貧血紅細(xì)胞左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒〔黃疸〕正常紅細(xì)胞溶血性貧血紅細(xì)胞左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒〔黃疸〕·分類：伯氨喹啉型藥物性溶血性貧血新生兒黃疸蠶豆病感染性溶血先天性非球形細(xì)胞溶血性貧血〔CNSHA〕紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶〔G6PD〕缺乏癥蠶豆病是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶〔G-6-PD〕缺乏所導(dǎo)致的疾病，表現(xiàn)為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶〔G-6-PD〕缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內(nèi)溶血。紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥主要臨床表現(xiàn)：早期有惡寒、微熱、頭昏、倦怠無力、食欲缺乏、腹痛，繼之出現(xiàn)黃疸、貧血、血紅蛋白尿，尿呈醬油色，此后體溫升高，倦怠乏力加重，可持續(xù)3日左右。與溶血性貧血出現(xiàn)的同時，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和腹痛加劇，肝臟腫大，肝功能異常，約50%患者脾腫大。嚴(yán)重病例可見昏迷、驚厥和急性腎衰竭，假設(shè)急救不及時常于1～2日內(nèi)死亡。遺傳方式：G6PD缺乏癥是一種X連鎖不完全顯性遺傳母：XX父：XY

子代：XXXXXYXY兒子一定患病，女兒那么50%母：XX

父：XY子代：XXXXXYXY兒子一定正常，女兒那么50%母：XX父：XY子代：XXXXXYXY女兒50%時機(jī)患病，兒子50%時機(jī)攜帶該基因X---致病基因患該病的男女比例約為=7:1從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果主要臨床表現(xiàn)：1.血尿、排醬油色尿、面色蒼白2.皮膚及鞏膜黃染3.體溫升高4.呼吸急促1.血尿、排醬油色尿、面色蒼白G6PD↓GSSG(氧化型谷胱甘肽)NADPH+H+NADP+AAH22GSH(復(fù)原型谷胱甘肽)GSH的主要作用：①保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)的含硫氫基〔-SH〕血紅蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化②與谷胱甘肽過氧化酶共同使H2O2復(fù)原成H2O→NADPH+H+↓→紅細(xì)胞的抗氧化能力↓→GSH↓→紅細(xì)胞膜破裂→溶血性貧血〔面色蒼白〕→游離Hb>腎吸收閾值→血紅蛋白尿/含鐵血黃素尿2.皮膚及鞏膜黃染機(jī)理：溶血性黃疸3.體溫升高機(jī)理：紅細(xì)胞破裂↓血紅蛋白暴露↓免疫系統(tǒng)攻擊〔單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)〕↓體溫升高4.呼吸急促溶血性貧血↓具有載O2能力的Hb含量下降↓機(jī)體缺O(jiān)2↓呼吸急促紅細(xì)胞1.98×1012/L↓↓〔〕×1012血紅蛋白53g/L↓↓〔170-200)g/L血清總膽紅素85.5μmol/L↑↑〔〕μmol/L結(jié)合膽紅素13.7μmol/L—未結(jié)合膽紅素71.8μmol/L↑↑尿蛋白〔++〕、潛血(+)尿膽紅素(－)、尿膽素原(+)從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果正常值2、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確診斷。貧血、黃疸有和無遺傳史無或有誘因〔食用蠶豆、服用藥物、感染〕體征：脾腫大、黃疸血常規(guī)檢查血清學(xué)檢查檢查HA的病因G6PD篩選試驗(yàn)G6PD確診試驗(yàn)Hb↓、網(wǎng)織紅細(xì)胞↑間接膽紅素↑尿膽原↑游離Hb↑結(jié)合珠蛋白↓疑心其他HA,相應(yīng)病因檢測結(jié)果正常G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)紅細(xì)胞G6PD活性測定G6PD基因分析其他篩選試驗(yàn)高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗(yàn)初診或確診G6PD缺陷癥確診溶貧〔血管內(nèi)溶血〕確診G6PD做1項(xiàng)或2項(xiàng)做1項(xiàng)高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗(yàn)

G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)紅細(xì)胞G6PD活性測定篩選試驗(yàn)→確診試驗(yàn)一、高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗(yàn)亞鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白亞硝酸鈉高鐵血紅蛋白復(fù)原酶NADPH(輔酶)亞甲藍(lán)(遞氫體)實(shí)驗(yàn)反響方向?qū)嶒?yàn)原理主要試劑：0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亞甲藍(lán)溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液〔等量①+②+③〕、生理鹽水、抗凝劑儀器：紫外分光光度計(jì)水浴箱、離心機(jī)、試管3支高鐵血紅單白復(fù)原實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程取靜脈血1.8mL于抗凝管，混勻抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝劑+葡萄糖20mg)離心沉淀1000r/min15min調(diào)整血細(xì)胞∶血漿=1∶1，混勻→調(diào)整后全血〔備用〕1ml0.18mol/L亞硝酸鈉1ml0.28mol/L葡萄糖溶液混勻→混合試劑〔備用〕

1ml0.14mmol/L亞甲基藍(lán)液高鐵血紅單白復(fù)原實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程取試管3支,標(biāo)上A、B、S,按下表參加試劑高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗(yàn)操作步驟混合試劑/mL0.01//生理鹽水/mL/0.01/0.18mol/L亞硝酸鈉-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL經(jīng)調(diào)整的全血/mL0.10.10.1來回?fù)u動15～20次,置37℃水浴箱靜置3h蒸餾水10.00ml10.00ml10.00ml

試劑ABS高鐵血紅單白復(fù)原實(shí)驗(yàn)B管為空白管,在波長635nm處，測定“A〞管及“S〞管吸光度實(shí)驗(yàn)流程計(jì)算高鐵血紅蛋白復(fù)原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%高鐵血紅單白復(fù)原實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過程本卷須知實(shí)驗(yàn)一〔高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗(yàn)〕：1、血細(xì)胞比容比值過低，高鐵血紅蛋白復(fù)原率降低。應(yīng)將血細(xì)胞比容調(diào)整到2、細(xì)菌污染可產(chǎn)生亞硝酸鹽而造成假陽性，試管等應(yīng)無菌3、不穩(wěn)定Hb、高脂血癥等均可出現(xiàn)假陽性結(jié)果，故應(yīng)2h內(nèi)送檢4、標(biāo)本不應(yīng)有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在標(biāo)本內(nèi)應(yīng)適當(dāng)參加葡萄糖，以防止較全血缺乏二、G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理：葡萄糖-6-磷酸〔G6P〕在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖〔6PGA〕,同時使NADP轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH,后者在340nm波長紫外線照射下產(chǎn)生熒光〔反響原理如以下圖〕。所以將含有G6P和NADP等的混合試劑與血混勻后在0分鐘、5分鐘、10分鐘分別取1滴血到濾紙上，通過觀察濾紙上有熒光出現(xiàn)時間可判斷G6PD活性

NADPNADPH

G6P

6PGAG6PD實(shí)驗(yàn)原理試劑：反響液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸鹽緩沖液3份和蒸餾水3份混勻儀器：長波紫外燈、濾紙、水浴箱G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)流程G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)取試管，加10μl全血+100μl反響液，混勻，取一滴于濾紙上〔第一斑點(diǎn)〕→作為對照將上液置于37℃水浴10min，再取一小滴滴于濾紙上〔第二斑點(diǎn)〕→實(shí)驗(yàn)組晾干后，于長波紫外燈下〔365nm〕觀察結(jié)果，計(jì)時根據(jù)結(jié)果作出相應(yīng)診斷實(shí)驗(yàn)二〔G6PD熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)〕：1、檢測的第一點(diǎn)作為實(shí)驗(yàn)對照應(yīng)無熒光或弱熒光出現(xiàn)2、每次試驗(yàn)應(yīng)用正常標(biāo)本〔G-6-PD正?！匙麝幮詫φ?。如可能選用G-6-PD缺乏者的標(biāo)本作陽性對照3、如貧血嚴(yán)重取血量應(yīng)相應(yīng)加大，或用紅細(xì)胞混懸液進(jìn)行檢驗(yàn)4、為提高敏感性可在反響液中參加1份8.0mmol/LGSSG實(shí)驗(yàn)過程本卷須知三、紅細(xì)胞G6PD活性測定實(shí)驗(yàn)原理：根本原理同G6PD熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。不同的是利用紫外光分光光度法定量測定酶活性，即每隔一分鐘在340nm波長測定孵育液中NADPH吸光度〔測6次〕，求每分鐘吸光度增加的平均值，根據(jù)單位時間內(nèi)NADPH生成由于所用試劑及體系的不同。方法：①WHO推薦的Zinkham;②NBT定量法等實(shí)驗(yàn)原理試劑：生理鹽水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris緩沖液〔pH7.5〕、0.63mol/L氯化鎂溶液、33mmol/LG-6-P液儀器：紫外分光光度計(jì)水浴箱、離心機(jī)、試管實(shí)驗(yàn)流程取抗凝血2ml，生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次〔1500r/min離心10min〕除去上清液和乳白層〔白細(xì)胞和血小板〕加等體積生理鹽水→紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min→

溶血液并測定其Hb濃度進(jìn)行比色〔見下表〕紅細(xì)胞G6PD活性測定G-6-PD活性測定的操作表〔Zinkham法)試管對照管測定管NADP液〔ml〕0.10.1Tris液〔ml〕0.10.1氯化鎂液〔ml〕0.10.1蒸餾水〔ml〕0.680.58G6P液〔ml〕—0.137℃預(yù)熱溶血液〔μl〕2020紅細(xì)胞G6PD活性測定立即340nm處測吸光度，以對照管調(diào)零，37℃恒溫，每分鐘觀察1次，記錄吸光度的變化實(shí)驗(yàn)流程計(jì)算公式：G-6-PD活性〔U/gHb〕=△A/min×1000/6.22×1020/20×Hb(gL-1)△A/min:每min吸光度的平均變化值1000/6.22:為微摩爾消光系數(shù)1020/20:總?cè)萘颗c溶血液的量之比；

實(shí)驗(yàn)流程紅細(xì)胞G6PD活性測定實(shí)驗(yàn)三〔紅細(xì)胞G6PD活性測定〕：1、急性溶血期后2~3個月再查或復(fù)查G6PD活性2、最好同時作陰性對照和陽性對照〔影響因素多〕3、離心沉底后應(yīng)取底層紅細(xì)胞測定G6PD活性實(shí)驗(yàn)過程本卷須知結(jié)果分析方法一、高鐵血紅蛋白復(fù)原試驗(yàn)：正常值：MHb復(fù)原率>=75%，臍血>=77%臨床診斷：純合子和半合子〔XY〕患者：MHb復(fù)原率<30%臍血<40%雜合子患者：MHb復(fù)原率<31%~74%臍血<41%~76%二、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)

正常人：0min斑點(diǎn)無熒光，5-10min出現(xiàn)，10min熒光最強(qiáng)臨床診斷：輕度缺陷者：0-10min熒光很弱或不出現(xiàn)中度缺陷者：10-30min出現(xiàn)熒光嚴(yán)重缺陷者：30min內(nèi)不出現(xiàn)熒光結(jié)果分析方法三、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測定G6PD缺陷者：G6PD活性較正常平均值低40%以上即可作出診斷

方法正常值范圍WHO推薦的Zinkham(12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推薦的Glock與McLoan法〔8.34±1.59〕IU/g