DB37-T 4204-2020 水貂阿留申病診斷與凈化技術(shù)

65.020.30B

41DB37 37/T

4204—2020水貂阿留申病診斷與凈化技術(shù)Aleutian

disease

diagnose

cleaning-up

technology

for

山東省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB37/T

4204—2020 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T

1.1—給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。究所、山東省動物衛(wèi)生技術(shù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王貴升、張鶴曉、馬澤芳、史秋梅、張洪學(xué)、趙國清、黃兵、徐啟杰、王蕾、李玉杰、劉長浩、徐鴻、李金波、馬慧玲、藺曉月、崔凱、陳靜、李富金、王士榮。DB37/T

4204—20201 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水貂阿留申病臨床診斷技術(shù)、病毒抗體檢測技術(shù)、熒光檢測、病獸淘汰技術(shù)、獸群飼養(yǎng)環(huán)境控制技術(shù)和無害化處理的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水貂阿留申病感染動物的篩選、感染控制與凈化。2 規(guī)范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB

7959 糞便無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB

8978污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)SN/T

2847 水貂阿留申病檢疫技術(shù)規(guī)范DB37/T

2381 規(guī)?；躔B(yǎng)殖場生物安全體系DB37/T

2660 規(guī)模化毛皮動物養(yǎng)殖場消毒技術(shù)3 臨床診斷3.1 流行病學(xué)3.1.1

90

7

個月～9

1

1

2

天～3

80

%3.1.2 傳染源主要為病貂和隱性感染貂。病毒的群間傳播主要是來自感染貂的唾液、糞便和尿，及其污染的環(huán)境、飼料、飲水和用具。經(jīng)消化道、呼吸道及交配傳染，也可通過母貂胎盤直接傳遞給子代。蚊蟲叮咬、注射器針頭等傳播途徑亦應(yīng)引起重視。3.1.3 有明顯的季節(jié)性，秋冬季節(jié)的發(fā)病率與病死率明顯地比其他季節(jié)高。3.1.4 本病為終生毒血癥。3.1.5 雪貂、狐貍、貉也可感染發(fā)病。3.2 臨床癥狀3.2.1 漸進(jìn)性消瘦：病貂食欲時好時壞，貂體逐漸消瘦，嚴(yán)重病貂體重急劇下降。3.2.2 出血和貧血：口腔、齒齦、軟腭、硬腭和舌根有大量出血點和出血斑，內(nèi)臟器官尤其是消化道出血，排出煤焦油樣糞便。貧血癥狀口腔黏膜、眼結(jié)膜和陰道黏膜及腳趾蒼白3.2.3 渴欲增強(qiáng)。3.2.4 如侵害神經(jīng)系統(tǒng)，表現(xiàn)抽搐、痙攣、共濟(jì)失調(diào)、后軀麻痹等癥狀，2

3

天死亡。3.2.5 本病預(yù)后不良，對癥治療可緩解癥狀。常復(fù)發(fā)，最后衰竭死亡。DB37/T

4204—20203.3 病理變化3.3.1 尸體營養(yǎng)不良，消瘦、貧血，內(nèi)臟出血。3.3.2 腎腫大

2

3

白色、圓形小點，皮質(zhì)切面為乳白色小點。3.3.3 肝、脾、淋巴結(jié)腫脹，肝呈土黃色，或見有灰白色斑點、質(zhì)脆；胸腺體積縮小。3.3.4 懷孕期發(fā)病可見死胎、胎兒液化、吸收或者出現(xiàn)木乃伊胎兒、子宮出血。3.3.5 癱瘓病例可見腦膜出血。4 抗體檢測4.1樣品的采集與保存4.1.1

離心管或者

1

mL～2

mL注射器、離心管架、剪刀或指甲剪、酒精棉、干脫脂棉、記號筆，有條件的使用采血板和毛細(xì)管。4.1.2 采血方法：將水貂保定，剪刀酒精棉消毒，中趾趾間毛細(xì)管采血或直接剪掉中趾趾尖擠出

mL～

mL

血，滴入離心管或注射器，脫脂棉壓迫止血，注明編號。4.1.3 樣品保存及運(yùn)輸：2

℃～8

℃，不超過

24

h。4.2樣品處理將裝有血液的離心管靜置，待血清析出，經(jīng)4

r/min離心3

～5

，取血清置于

mL離心管中。4.3 對流免疫檢測按照SN/T

2847的要求進(jìn)行檢測。5 熒光

5.1 儀器設(shè)備5.1.1

熒光

檢測儀及配套反應(yīng)管（板）。5.1.2

小型臺式低溫高速離心機(jī)（離心速度

13

r/min

以上）。5.1.3

混勻器。5.1.4

冰箱（2

8

℃和

℃兩種）。5.1.5

0.5

μ

L～10

μ

L；2

μ

L～20

μ

L；20

μ

L～200

μ

L；100

μ

L～1

μ

L吸頭。5.1.6

1.5

mL

離心管（無核酸酶）。5.1.7

DNA

核酸提取試劑5.2 試劑或材料5.2.1 陰性質(zhì)控。5.2.2 陽性質(zhì)控。5.2.3 蛋白酶

K。DB37/T

4204—20205.2.4 SDS。5.2.5 或商品化實時熒光定量

試劑盒。5.3 樣品的采集與保存5.3.1 拭子樣品有咽喉拭子樣品和肛拭子樣品：a)

3

次～5

子插入到裝有

mL

無菌離心管管中，編號備用；b)

3

5

1.0

mL

PBS

無菌管中，編號備用。5.3.2 內(nèi)臟或肌肉樣品用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品

g

mL

PBS轉(zhuǎn)入無菌管中，編號備用。5.3.3血清或血漿用無菌注射器直接吸取至無菌管中，編號備用。5.3.4存放采集或處理的樣本在2

8

℃條件下保存，不超過24

h。5.4 實驗步驟5.4.1 樣本病毒核酸

普通提取方法，或者采用經(jīng)驗證的病毒提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取。5.4.2 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備5.4.2.1

VP2

168

bp

A。根據(jù)需要配制熒光

反應(yīng)液或購買商品化試劑盒。5.4.2.2 熒光

反應(yīng)液，在室溫下融化后，2

r/min

5

。5.4.2.3 準(zhǔn)備

n

n（n

=樣本數(shù)

照+1

管陽性對照）。5.4.2.4 每個測試反應(yīng)體系需要

μ

L

反應(yīng)液和

μ

L

Taq

酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混合均勻，向每個

PCR

管中各分裝

15

μ

L，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。5.4.3 加樣在樣品處理區(qū)進(jìn)行。分別向上述管中加入樣本核酸提取步驟中制備的DNA溶液10

μ

L，蓋緊管蓋，

r/min離心

sec。5.4.4 熒光

在檢測區(qū)進(jìn)行。將加樣后的PCR管放入熒光檢測儀內(nèi)，記錄管擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：第一階段，94

℃/3

min94

℃/15

sec，60

℃/60

sec共4040

℃/2

在第二階段每次循環(huán)的60

℃延伸時進(jìn)行。DB37/T

4204—20205.5 結(jié)果判定5.5.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定選定檢測通道讀取檢測結(jié)果；ABI儀器，選擇FAM作為報告熒光基團(tuán)，無淬滅熒光基團(tuán)。5.5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)5.5.2.1陰性對照無

Ct/Cp

值并且無擴(kuò)增曲線。5.5.2.2 陽性對照的

Ct/Cp

值應(yīng)小于等于

28，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。5.5.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。5.5.3 結(jié)果判定陰性：無Ct/Cp值，且無特征性擴(kuò)增曲線，表明樣品為陰性。陽性：Ct/Cp30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品為陽性。復(fù)驗：Ct/Cp值大于30.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品建議復(fù)驗。復(fù)驗仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性，否則判為陰性。5.6 實驗室規(guī)范熒光檢測方法的實驗室規(guī)范詳見附錄B。6 病獸淘汰6.1 檢測方法的選擇：抗體檢測技術(shù)適用于群體檢測，

檢測技術(shù)適應(yīng)小規(guī)模檢測和抗體陽性樣品的進(jìn)一步確診。不同實驗室可以根據(jù)樣品量、樣品種類以及檢測目的選擇使用。6.2分群：定期開展檢測工作，檢測出陽性樣品后，結(jié)合臨床癥狀，初步確定陽性水貂和陰性水貂，立即分群，并對陽性貂進(jìn)行隔離。6.3 一次性凈化：把檢測出的陽性水貂直接淘汰，或作為皮獸飼養(yǎng)，不再留作種用。6.4 逐步凈化：實行阿留申病毒陰陽性貂分場（群）飼養(yǎng)，逐步淘汰陽性貂。分（場）群后，應(yīng)建立勿混合。7 獸群環(huán)境控制7.1 阿留申病陰性群：做好生物安全控制，日常管理遵照

DB37/T

2381

的規(guī)定執(zhí)行。7.2

2660

8 無害化處理8.1 廢棄物處理對污染的飼料、墊料等廢棄物以及糞便、污水應(yīng)按照GB

7959和GB

8978進(jìn)行無害化處理。8.2 病死水貂處理DB37/T

4204—2020病死水貂按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定進(jìn)行無害化處理。8.3 記錄與檔案案的保存時間不得少于2DB37/T

4204—2020AA附

錄 A（資料性附錄）引物和探針F CAACCCTCCAGGTCAACTCTR CTCTTAACAGGATTCCAGCATGTP FAM-AAGCTTGCCTCTCCAAGTAAAGTAACCA-BHQ1DB37/T

4204—2020BB附

錄 B（資料性附錄）水貂阿留申病毒熒光

PCR

檢測方法的實驗室規(guī)范B.1 實驗室設(shè)置要求實驗室設(shè)置要求如下：——實驗室分為三個相對獨立的區(qū)域：樣本制備區(qū)、反應(yīng)混合物配置區(qū)和檢測區(qū)；——工作區(qū)域須有明確標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用；——每一區(qū)域須有專用的儀器設(shè)備——整個實驗過程中均須使用無

RNA

酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前須

250

℃干烤

4

h以上，以徹底去除

設(shè)備物品發(fā)生混淆；測區(qū)；——在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別；離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出；——實驗室清潔時應(yīng)該樣本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配置區(qū)至檢測區(qū)的順序進(jìn)行；——不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。B.2工作區(qū)域儀器設(shè)備配置B.2.1 樣本制備區(qū)樣本制備區(qū)需配置如下儀器設(shè)備：——2

℃～8

℃冰箱；——-20

℃冰箱；——高速臺式冷凍離心機(jī)（4

℃，12

000

r/min——混勻器；——微量加樣器（

μ

L～

μ

L，5

μ

L～20

μ

L，20

μ

L～

μ

L，200

μ

L～1

000

μ

L——可移動紫外燈（近工作臺面）。B.2.2 檢測區(qū)檢測區(qū)需配置如下儀器設(shè)備：——熒光

儀（配計算機(jī)）；——移動紫外燈；——打印機(jī)。B.3 各工作區(qū)域功能及注意事項DB37/T

4204—2020B.3.1 樣本制備區(qū)樣本制備區(qū)的功能及注意事項如下：——樣本的保存，核酸提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管在樣本制備區(qū)進(jìn)行；成污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須立即蓋嚴(yán)含反應(yīng)混合物的反應(yīng)管；須作清潔處理并作出記錄；——對實驗臺適當(dāng)?shù)淖贤庹丈洌?54

nm

波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染。工作后通過移動紫外線燈管來確保實驗臺面的充分照射。B.3.