毒理學實驗課件

毒理學實驗1實驗一

實驗動物的一般操作技術(shù)2一、目的二、內(nèi)容（一）實驗動物的選擇1、物種的選擇：嚙齒類、非嚙齒類基本原則：代謝、生化、毒理學特征與人最接近的自然壽命不太長的易于飼養(yǎng)和實驗操作的經(jīng)濟且易于獲得的32、品系的選擇：遺傳學控制分類近交系：純品系雜交群：F1代封閉群：5年內(nèi)，隨機交配遺傳均一性：一種毒物固定使用同種品系43、微生物學和寄生蟲控制的選擇Ⅰ級：普通動物，開放系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅱ級：清潔動物，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅲ級：SPF動動，屏障/隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅳ級：無菌動物，隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)54、個體選擇性別：年齡：急性、慢性以體重估計：組內(nèi)、組間差異生理狀態(tài)：雌--未產(chǎn)未孕，避免妊娠、激素影響健康狀況：健康動物健康動物辨認：6健康動物辨認：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動迅速、反應靈活，食欲及營養(yǎng)狀況良好。(1)眼：明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無分泌物。(2)耳，耳道無分泌物溢出，耳殼無膿瘡。(3)鼻：無噴嚏，無漿性粘液分泌物。(4)皮膚：無創(chuàng)傷、無膿瘡、疥癬、濕疹。(5)頸部：要求頸項端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應選作實驗動物。(6)消化道：無嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。(7)神經(jīng)系統(tǒng)：無震顫、麻痹。若動物(大鼠、小鼠)出現(xiàn)圓圈動作或提尾倒置呈圓圈擺應放棄該動物。(8)四肢及尾：四肢、趾及尾無紅腫及潰瘍。7（二）動物性別鑒定(1)大鼠、小鼠：主要依肛門與生殖孔間的距離區(qū)分，間距大者為雄性，小者為雌性。成年雄鼠臥位可見到辜丸，雌性在腹部可見乳頭。(2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠頸部，另一只手扒開靠生殖器孔的皮膚，雄性動物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動物則顯示三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個乳頭。8（三）動物抓取正確地抓取固定動物，既不損害動物健康、不影響觀察指標，又防止被動物咬傷(1)小鼠：先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嶒炁_上向后拉，在其向前爬行時，用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚，將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。9(2)大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中。10(3)豚鼠：豚鼠膽小易驚，在抓取時要穩(wěn)、準、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，另一只手托住臀部即可。(4)兔：用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。11（四）實驗動物稱重、編號、標記染色法：苦味酸、品紅耳緣孔口標記：項圈（五）動物隨機分組：隨機數(shù)字表12（六）染毒途徑和方法經(jīng)口（胃腸道）染毒喂飼：不易揮發(fā)、不易水解、無異味、不影響營養(yǎng)吞咽膠囊：灌胃：灌前禁食空腹，不飲水小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動物固定，右手持注射器，將灌胃針插入動物口中，沿咽后壁徐徐插入食管。針插入時應無阻力，若感到阻力或動物掙扎，應立即停止進針或?qū)⑨槹纬?，以免損傷或穿破食管及誤入氣管。13經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入動式吸入氣管內(nèi)注入14經(jīng)皮膚染毒斑貼法（家兔）被毛的去除：剪毛、拔毛、脫毛浸尾法（大、小鼠）注射染毒：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮內(nèi)注射15（七）生物標本采集1.血液采集：大、小鼠鼠尾采血法眼眶靜脈叢采血法腹主動脈或股動(靜)脈采血法斷頭采血法家兔耳緣靜脈采血法心臟采血法16實驗動物安全采血量動物品種最大安全采血量(ml)最小致死采血量(ml)小鼠0.10.3大鼠1.02.0豚鼠5.010.0家兔10.040.0172.尿液、糞便收集：代謝籠（八）動物處死脊椎脫臼法斷頭法急性大失血法擊打法麻醉致死法麻醉后急性放血法空氣栓塞法化學藥物致死法開放性氣胸法18微核實驗動物染毒陰性對照組：生理鹽水陽性對照組：環(huán)磷酰胺40-60mg/kg高劑量組：敵敵畏20mg/kg中劑量組：敵敵畏10mg/kg低劑量組：敵敵畏5mg/kg19實驗二

急性經(jīng)口毒性試驗20一、目的掌握LD50計算方法和急性毒性分級標準熟悉經(jīng)口灌胃技術(shù)了解急性毒性試驗的設計原則21急性毒性、急性毒性分級標準急性毒性：一次或多次接觸，短時間產(chǎn)生的毒性效應，包括一般行為和外觀改變，大體形態(tài)改變以及死亡效應等。農(nóng)藥的急性毒性分級：低、中、高、劇毒22LD50計算方法改良寇氏法：計算簡便，準確率高，常用霍恩法序貫法Bliss法23改良寇氏法要求每組動物數(shù)相等各劑量組組距呈等比級數(shù)死亡呈正態(tài)分布最低劑量組死亡<20%最高劑量組死亡>80%死亡不倒置24二、原理健康動物按體重隨機分組一次或多次經(jīng)口給藥觀察中毒特征或死亡劑量-反應關(guān)系求出LD50毒性分級25三、材料與試劑動物：昆明種小白鼠器材：試劑：敵敵畏，苦味酸26四、步驟動物選擇劑量設計：5-8個劑量（一般不設對照組）最高、高、中、低、最低5個劑量,中劑量組：100mg/kg，組距1.4動物稱重、編號、標記受試物配制灌胃：1ml/100g體重觀察：急性毒性試驗原始記錄2728LD50計算：LD50及95%可信區(qū)間29計算公式m=Xk-i(∑p-0.5)m：lgLD50i:相鄰兩劑量組對數(shù)值的差Xk：最大劑量的對數(shù)值P：死亡率q:存活率n：每組動物數(shù)∑p=各劑量組死亡率總和30五、評價：毒性分級、毒性特征六、討論：31實驗二

皮膚刺激性/腐蝕性試驗（豚鼠）32試驗目的確定化學物對哺乳動物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護化學物對皮膚的刺激保護措施提供依據(jù)。33皮膚刺激性(DermalIrritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性(DermalCorrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。34試驗的基本原則將受試物一次(或多次)涂敷于受試動物的皮膚上，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，觀察動物皮膚局部刺激作用的程度并進行評分。采用自身對照，以評價受試物對皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗觀察期限應足以評價該作用的可逆性或不可逆性。35強酸或強堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于可預見其腐蝕特性，不必做本試驗；若已知受試樣品有很強的經(jīng)皮吸收毒性（LD50≤200mg/kgbw）的物質(zhì)不必進行本試驗；36試驗方法1、受試樣品液態(tài)受試樣品采用原液或人類實際應用濃度固體受試樣品經(jīng)研磨，過100目篩后用水或適當?shù)馁x形劑（如凡士林、阿拉伯樹膠、乙醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等）按一定比例調(diào)制，以保證與皮膚充分接觸。372、實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。至少需要4只健康成年動物（雄性和/或雌性均可）。每只動物相鄰的未處理的皮膚可作為對照。每只單籠飼養(yǎng)，試驗前動物要在實驗室中適應3d。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水383、劑量設計受試樣品0.5ml(g)，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身毒性等原因，用量可適當減少。但為了試驗的一致性，測試面積應力求相等。394、試驗步驟1）試驗前準備試驗前24h，將實驗動物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無損的動物進行試驗。不應在長有濃密島狀毛的部位進行受試樣品試驗。402）染毒受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對照。采用封閉試驗，敷用時間為4h。41對化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實際使用和產(chǎn)品類型，延長或縮短敷用時間。對用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用2h敷用試驗。試驗結(jié)束后用溫水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。42如懷疑受試樣品可能引起嚴重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗，將三個涂布受試樣品的紗布塊同時或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時間點出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗。433）觀察期限觀察時間的確定應足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過程，一般不超過14d。于清除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反應，按表1進行皮膚反應評分，以受試動物積分的平均值進行綜合評價，根據(jù)24、48和72h各觀察時點最高積分均值，按表2判定皮膚刺激強度。4445465、試驗報告試驗報告應以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量。必要時說明pH值實驗動物種屬、品系、性別、體重和來源(合格證號和級別)實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境：飼料來源、室溫、相對濕度、動物房合格證號每個動物在每一觀察時點的皮膚刺激反應積分具體描述除刺激性以外的其它毒性作用結(jié)論47488試驗結(jié)果的解釋急性皮膚刺激試驗結(jié)果從動物外推到人的可靠性很有限。白色家兔和豚鼠在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動物進行試驗時也得到類似結(jié)果，則會增加從動物外推到人的可靠性。試驗中使用封閉式接觸是一種超常的實驗室條件下的試驗，在人類實際接觸化學品過程中很少存在這種接觸方式。49附：多次皮膚刺激性試驗步驟1試驗前將實驗動物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為2cm×3cm，涂抹面積2.5cm×2.5cm。2取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，當受試物使用無刺激性溶劑配制時，另一側(cè)涂溶劑作為對照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14d。從第二天開始，每次涂抹前應剪毛，用水或無刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時后觀察結(jié)果，按表1評分，對照區(qū)和試驗區(qū)同樣處理。50結(jié)果評價：按下列公式計算每天每只動物平均積分，以表2判定皮膚刺激強度。5152DDV：LD50：50～80mg/kg(大鼠經(jīng)口)；75-107，113mg/kg(大鼠經(jīng)皮)；LC50：15mg/(大鼠吸入，4h)二甲苯：LD50：5000mg/kg（大鼠經(jīng)口）；LC50：1947mg/m3（大鼠吸入）;輕微粘膜刺激。引起皮膚發(fā)紅。家兔經(jīng)皮：500mg/24h，中度刺激甲醛：急性毒性：LD50800mg/kg（大鼠經(jīng)口），2700mg/kg（兔經(jīng)皮）；LC50590mg/m3（大鼠吸入）；人吸入60～120mg/m3，發(fā)生支氣管炎、肺部嚴重損害；人吸入12～24mg/m3，，鼻、咽粘膜嚴重灼務、流淚、咳嗽；人經(jīng)口10～20ml，致死。53實驗三

小鼠骨髓細胞微核試驗54一、目的：掌握小鼠骨髓PCE微核測定方法二、原理染色體斷裂染色體完整性紡錘絲受影響染色體分離改變有核細胞：難與核的分葉鑒別紅細胞：最后一次分裂后將主核排出（PCE）PCE24小時NCE（大多微核排出）55三、材料、試劑試劑：受試物、陽性物、小牛血清、染液等動物器材56四、步驟動物選擇：雌雄各半劑量選擇：陰性、陽性對照，3-5個劑量組