雷帕霉素對哮喘小鼠氣道重塑的影響

雷帕霉素對哮喘小鼠氣道重塑的影響延光海;金光玉;樸紅梅;鄭明昱;李良昌;李光昭【摘要】目的利用雷帕霉素探討哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在支氣管哮喘小鼠氣道重塑中的作用機(jī)制?方法30只￡清潔級BABL/c小鼠，隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只，分別為生理鹽水對照組、卵蛋白(OVA)哮喘組、雷帕霉素治療組?在末次激發(fā)24h后所有小鼠取左肺組織行蘇木精-伊紅(HE)染色,PAS染色及mTOR免疫組織化學(xué)染色?分別用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和Westernblot檢測支氣管月市泡灌洗液(BALF)中IL-4、IL-5、IL-13含量以及右肺組織mTOR蛋白表達(dá).應(yīng)用小鼠肺功能儀檢測氣道阻力的變化?結(jié)果哮喘模型組小鼠與對照組相比較BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平增高;肺組織mTOR蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組(PvO.01).雷帕霉素治療組與哮喘模型組相比較BALF中IL-4、IL-5、IL-13含量及肺組織mTOR表達(dá)水平均降低，差異具有顯著性(PvO.05).結(jié)論雷帕霉素可抑制哮喘小鼠氣道重塑的發(fā)生，其機(jī)制有可能是通過阻斷mTOR信號通路而實(shí)現(xiàn)的.%AimToexploretheeffectofrapamycinonairwayremodelingandtheexpressionofmTORinasthmaticmice.MethodsThirtymaleBABL/cmicewererandomlydividedintothreegroupswith10miceineachgroup:controlgroup,OVAgroup,andrapamycingroup.Theleftlungwasisolatedforpathologicalexamination.LungsectionswerestainedwithHEandPASimmunohistochemistry.TheconcentrationsofIL-4,IL-5,IL-3inBALFwereexaminedbyELISA,andthemTORfromtherightlungtissueswasdetectedbyWesternblot.Thechangesoftheairwayresistanceandlungfunctionwereanalyzedbymeansofanimallungsfunctionanalysissystem.ResultsInOVAgroup,thenumberofinflammatorycellsandtheconcentrationsofIL-4,IL-5,IL-3inBALFandbronchialairwaythickness,bronchialsmoothmusclethickness,andmTORinlungtissueweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup(P<0.05).Inrapamycingroup,thenumberofinflammatorycells,theconcentrationsofIL-4,IL-5,IL-3inBALFandbronchialairwaythickness,bronchialsmoothmusclethickness,andmTORinlungtissueweresignificantlylowerthanthoseinOVAgroup(P<0.05).TheaboveindicesofRapamycingroupweresignificantlylowerthanthoseofOVAgroup(P<0.05).ConclusionRapamycincaninhibitthedevelopmentofairwayremodelinginasthmaticmice,andthepossiblemechanismmaybeduetoitsinhibitionofmTORsignaling.【期刊名稱】《中國藥理學(xué)通報(bào)》年(卷),期】2013(029)007【總頁數(shù)】5頁(P942-946)【關(guān)鍵詞】支氣管哮喘;氣道重塑;雷帕霉素；mTOR;IL-4;IL-5;IL-13【作者】延光海;金光玉;樸紅梅;鄭明昱;李良昌;李光昭【作者單位】延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研部,吉林,延吉,133002;延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林,延吉,133002;延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,吉林,延吉,133002;延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)教研室,吉林,延吉,133002;延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研部,吉林,延吉,133002;延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研部,吉林,延吉,133002正文語種】中文【中圖分類】R-332;R322.35;R392.11;R562.102.2;R562.250.22氣道重塑（airwayremodeling）是支氣管哮喘的重要特征之一，表現(xiàn)為氣道平滑肌增厚、杯狀細(xì)胞增生、上皮下纖維化、肌成纖維細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等［1］。mTOR屬于磷酸肌醇激酶3相關(guān)激酶（PIKKs）家族的一員，是PI3K/Akt的下游底物，可通過改變翻譯調(diào)節(jié)因子p70s6k和4E-BPI的磷酸化狀態(tài)啟動(dòng)翻譯過程。近年來研究表明mTOR與人體炎癥、損傷、增生、組織修復(fù)、纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列重要的病理生理過程密切相關(guān)［2－3］。在本研究中，我們給予mTOR抑制劑雷帕霉素（rapamycin）觀察肺泡灌洗液和肺組織中各種炎性因子的變化，探討雷帕霉素有無選擇性抑制氣道炎癥，而進(jìn)一步闡明其阻止氣道重塑的發(fā)生機(jī)制。材料1.1動(dòng)物EBALB/c小鼠30只，體質(zhì)量（18±5）g,由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號，SCXK（吉）2011-0007。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即正常對照組、哮喘模型組、雷帕霉素治療組，每組10只。1.2藥品與試劑卵蛋白（OVA,Sigma）;氫氧化鋁粉（分析純，Sigma）;細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13檢測試劑盒（北京晶美生物工程有限公司）。mTOR抗體為美國SantaCruz產(chǎn)品。1.3儀器設(shè)備霧化器（大連醫(yī)療器械廠U219，歐姆龍）;酶聯(lián)免疫檢測儀（RT-2100C,美國）;電泳儀及電泳槽（E-CApparatusCorporation，美國）;Westernblot轉(zhuǎn)膜儀（BioRad公司）。方法2.1動(dòng)物模型的復(fù)制模型制備參照延光海等［4］報(bào)道的方法:哮喘組和雷帕霉素治療組均用0.5ml致敏混懸液〔含OVA8pg和AL（OH）3干粉4mg〕腹腔內(nèi)共注射2次，注射間隔時(shí)間為5d(d1及d6),對照組用生理鹽水0.5ml代替。自d18開始激發(fā)，哮喘組和雷帕霉素治療組予以1%0VA生理鹽水5ml霧化吸入，每日1次，每次30min，分別持續(xù)7d。對照組用生理鹽水5ml代替OVA處理。激發(fā)之前正常對照組和哮喘模型組氣道內(nèi)給予生理鹽水0.5ml;雷帕霉素治療組分別在激發(fā)1d前開始?xì)獾纼?nèi)給予稀釋于生理鹽水中的4mg?kg-1的雷帕霉素，每天1次，給予4d。末次激發(fā)24h后處死小鼠，剪開頸部皮膚，并于氣管正中處剪一小口，插入氣管套管。以磷酸鹽緩沖液1ml行支氣管肺泡灌洗，來回沖洗3次，收集BALF?；靹駼ALF,3000r?min-1離心10min，取上清液，-80°C低溫保存，待測細(xì)胞因子。2.2BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13含量的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以ng?L-1表示。2.3組織學(xué)檢查肺組織經(jīng)甲醛固定后，常規(guī)脫水包埋，并做蘇木精-伊紅(HE)染色和PAS染色。每只小鼠隨機(jī)選3張肺組織切片，每張切片以單盲法隨機(jī)選取橫斷面較圓、直徑100pm的細(xì)支氣管5支觀察。2.4免疫組化流程及半定量測定使用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結(jié)法(streptavidinperosidase,SP法)進(jìn)行檢測。組織切片脫蠟后置于0.01mol?L-1檸檬酸緩沖液(pH值6.0)微波15min抗原修復(fù)，冷卻后用3g?L-1H2O2處理30min(37C),滅活內(nèi)源性過氧化物酶;1:10正常馬血清封閉30min(37C);棄上清液后直接加抗鼠mT0R(1:400稀釋)一抗，4C過夜;依次加羊抗鼠抗體與辣根過氧化酶室溫下各孵育30min(37C);滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫顯色。結(jié)果判定為陽性細(xì)胞呈棕色，陽性信號為胞質(zhì)/胞核內(nèi)棕黃色顆粒。采用Image-proPlus6.0圖像分析軟件測定mTOR含量，以校正后的平均光密度表示。平均光密度為累積光密度(IODSUM)除以選定區(qū)域的面積(areaSUM)。2.5肺組織mTOR蛋白表達(dá)檢測取200mg肺組織置入分別加入蛋白裂解液0.5ml勻漿，4°C12OOOxg離心2min，取上清液測蛋白濃度。取25g蛋白煮沸5min后，經(jīng)15%SDS電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，在5%脫脂奶粉-PBST溶液室溫下封閉2h,加入mTOR抗體4C孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG,稀釋度為1:200,37C,1h。洗膜后在暗室中加ECL發(fā)光試劑，X線膠片曝光1~2min后顯影、定影。雜交信號在圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行光密度掃描。應(yīng)用P-actin作為蛋白上樣量對照，其余組與其相比得到相對量,取均值。2.6氣道高反應(yīng)的檢測所有動(dòng)物于OVA吸入后24h行支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)。給予4%戊巴比妥，按60mg?kg-1BW劑量行腹腔注射麻醉，待其疼痛反射消失后，將小鼠仰臥位置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺功能檢測分析系統(tǒng)(AniRes2005，北京貝蘭博科技有限公司)的體積描記箱內(nèi),切開皮膚分離皮下組織,暴露氣管連接動(dòng)物呼吸機(jī),插入氣管插管。游離頸外靜脈并穿刺,固定針柄,封閉體描箱。按濃度倍增法依次靜脈注射甲乙酰膽堿(methacholine2.5、5.0、10、25.50g?L-1)，頸外靜脈每次注射0.2ml。待氣道阻力降至正常后開始下一劑量，記錄波形及數(shù)據(jù)。2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)值用士s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。結(jié)果3.1BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-3的變化從Tab1中可見，哮喘模型組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-3水平升高，與正常對照組比較，差異有顯著性(P<0.05);雷帕霉素干預(yù)組大鼠BALF中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-3水平降低，與哮喘模型組比較，差異有顯著性(P<0.05)。Tab1ChangesofIL-4,IL-5,IL-3levelinBALF(±s,n=10)##P<0.01vssalinegroup;*P<0.05vsOVAgroupGroupIL-4/ng?L-1IL-5/ng?L-1IL-3/ng?L-1Saline14.9±1.319.8±4.321.2±11.5OVA56.5±4.2##62.7±8.6##86.4±14.7##Rapamycin47.9±3.4*50.2±6.3*60.1±11.3*3.2肺組織的病理學(xué)改變光鏡下觀察HE染色、PAS染色結(jié)果顯示，F(xiàn)ig1的A、D為正常對照組氣道無明顯改變。Fig1的B、E為哮喘模型組氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，杯狀細(xì)胞化生，炎癥細(xì)胞(尤其嗜酸性粒細(xì)胞)明顯增多，黏膜下層增寬，黏膜上皮增生，管腔被黏液所堵塞與正常對照組比較差異有顯著性(Pv0.01):Fig1的C、F雷帕霉素治療組上述改變較哮喘組明顯減輕，與模型組比較差異有顯著性(PvO.01)。Fig1EffectofRapamycinoninfiltrationofinflammatorycells(x200)A,D:Salinegroup;B，E:Asthmaticgroup;C，F(xiàn):Rapamycingroup3.3免疫組織化學(xué)染色檢測肺組織mTOR蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示正常對照組(Fig2A)小鼠支氣管mTOR蛋白呈淡棕黃色弱免疫反應(yīng)表達(dá)。哮喘模型組(Fig2B)小鼠氣道平滑肌、嗜酸性粒細(xì)胞，杯狀細(xì)胞mTOR蛋白呈強(qiáng)棕黃色強(qiáng)免疫反應(yīng)表達(dá)，與正常對照組比較差異有顯著性(Pv0.01)。雷帕霉素治療組Fig2C與哮喘模型組相比較，氣道平滑肌、嗜酸性粒細(xì)胞，杯狀細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)明顯減弱，與模型組比較差異有顯著性(Pv0.01)。3.4肺組織mTOR蛋白表達(dá)水平哮喘模型組肺組織的mTOR蛋白表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pv0.01);哮喘組肺組織的mTOR蛋白表達(dá)高于雷帕霉素治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pv0.01)。見Fig3。3.5雷帕霉素對氣道高反應(yīng)的影響隨著甲乙酰膽堿濃度的成倍遞增，模型組與對照組的吸氣阻力均有增加，當(dāng)濃度到達(dá)10g?L-1以上時(shí)，模型組與對照組比較差異有顯著性(Pv0.01)，見Fig4。討論支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞和多種炎癥介質(zhì)參與的慢性氣道炎癥。Th2細(xì)胞亞群主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-3等細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生、聚集、活化、脫顆粒，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgE等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及I型變態(tài)反應(yīng)［5］。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素干預(yù)組與哮喘模型組比較BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及IL-4、IL-5、IL-3水平降低。Fig2ImmunohistochemistrystainingofmTORproteininlung(x200)A:Salinegroup;B:Asthmaticgroup;C:RapamycingroupFig3EffectofmTORproteinexpressioninlungtissuesandofOVA-sensitizedand-challengedmiceA:WesternblotofmTORprotein.ThemRNAexpressionofthesecytokineswasmeasuredat48hafterthelastchallengeinmice;B:Densitometricanalyseswerepresentedastherelativeratioofeachmoleculetop-actin.Therelativeratioofeachmoleculeinthelungtissuesofcontrolwasarbitrarilypresentedas1.##Pv0.01vssalinegroup;**P<0.01vsasthmaticgroupFig4EffectofRapamycinonairwayhyperresponsivness(AHR)tomethacholine##P<0.01vssalinegroup;*P<0.05vsOVAgroup雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能抑制許多細(xì)胞的增生，包括T細(xì)胞分化、氣道平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等［6］。雷帕霉素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)是mTOR，進(jìn)入細(xì)胞與FKBP12形成RPM/FKBP12復(fù)合物，復(fù)合物結(jié)合mTOR并以滅其功能，從而阻斷了mTOR介導(dǎo)的信號通路。近期研究表明，T細(xì)胞缺乏mTOR時(shí)不能轉(zhuǎn)變?yōu)門h1、Th2或Th17效應(yīng)細(xì)胞［7］。這些研究指出mTOR在T細(xì)胞分化過程中扮演著極其重要的角色。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在哮喘模型組嗜酸性粒細(xì)胞過度表達(dá)mTOR蛋白，說明嗜酸性粒細(xì)胞的活化、聚集與mTOR蛋白的激活密切相關(guān)°IL-4是誘導(dǎo)Th2淋巴細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-4誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生IgE，最終形成以IgE依賴為特征的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的慢性氣道炎癥［8］;IL-5通過調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的活化、聚集、脫顆粒等參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展［9］；研究表明IL-3產(chǎn)于Th2細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，是支氣管哮喘的中樞調(diào)點(diǎn)，氣道內(nèi)IL-3水平增加、其表達(dá)與氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞增加數(shù)量產(chǎn)生有關(guān)［10］。以上研究表明mTOR的激活可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞活化與聚集，并進(jìn)一步誘導(dǎo)釋放和激活I(lǐng)L-4、IL-5、IL-3等炎癥細(xì)胞因子的釋放。研究證明mTOR/p70S6K信號通路在氣道平滑肌的生長和增殖中起著關(guān)鍵作用，可能是防止哮喘中平滑肌重塑的選擇性靶點(diǎn)［11］。本實(shí)驗(yàn)中我們研究發(fā)現(xiàn)哮喘模型組增生的氣道平滑肌過度表達(dá)mTOR蛋白，說明mTOR激活可誘導(dǎo)氣道平滑肌增生、肥大。氣道高反應(yīng)性(AHR)是哮喘的特征性表現(xiàn)之一，它的出現(xiàn)表示氣道平滑肌收縮閾值降低。研究證實(shí)AHR和氣道平滑肌增生、肥大密切相關(guān)［12］,而氣道炎癥可誘導(dǎo)氣道平滑肌增生與肥大［13］。通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路降低Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，近而減輕了氣道炎癥，同時(shí)減輕了由于炎癥本身引起的氣道阻力增加。對于雷帕霉素如何調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮有待進(jìn)一步探討。綜上所述，我們推測雷帕霉素對氣道平滑肌增殖和氣道杯狀細(xì)胞過度活化的抑制作用是通過阻斷mTOR信號途徑而實(shí)現(xiàn)的。參考文獻(xiàn):［1］ ManetschM，CheW，SeidelP，etal.MKP-1:AnegativefeedbackeffectorthatrepressesMAPK-mediatedpro-inflammatorysignalingpathwaysandcytokinesecretioninhumanairwaysmoothmusclecells［J］.CellSignal，2012，24(4):907－13.［2］吳苗苗，苑玉和，陳乃宏.mTOR信號通路與神經(jīng)退行性疾病研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(11):1481－3.［2］ WuMM，YuanYH，ChenNH.ResearchprogressonthemTORsignalingpathwayandneurodegenerativedisease[J].ChinPharmacolBull，2011，27(11):1481－3.[3]于春艷，李洪巖，鐘加滕，等?維生素K3通過下調(diào)mTOR信號途徑而誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，25(9):1173-6.[3]YuCY,LiHY,ZhongJT,etal.VitaminK引nducesautophagyinHeLacellsthroughdownregulatingthemammaliantargetofrapamycin(mTOR)pathway[J].ChinPharmacolBull，2011，25(9):1173-6.[4]延光海，樸紅梅，安昌善，等.Pyrin重組蛋白對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的影響[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2012,32(2):102-7.YanGH，PiaoHM，AnCS，etal.TheinhibitoryeffectsandmechanismofPyrinrecombinationproteinonairwayintlamationinmouSewithbronchialasthma[J].ChinMicrobiolImmunol，2012，32(2):102-7.ChoiYH，JinGY，GuoHS，etal.Silibininattenuatesallergicairwayinflammationinmice[J].BiochemBiophysResCommun，2012，427(3):450-5.GoncharovaEA，LimPN，ChisolmA，etal.Interferonsmodulatemitogen-inducedproteinsynthesisinairwaysmoothmuscle[J].AmJPhysiolLungCellMolPhysiol，2010，299(1):L25-35.DelgoffeGM，KoleTP，ZhengY，etal.ThemTORkinasedifferentiallyregulateseffectorandregulatoryTcelllineagecommitment[J].Immunity，2009，30(6):832-44.KeskinO，KeskinM，KucukosmanogluE，etal.ExhaledRANTESandinterleukin4levelsafterexercisechallengeinchildrenwithasthma[J].AnnAllergyAsthmaImmunol，2012，109(5):303-8.JakielaB，Sz