高效液相色譜儀HPLC使用資料點滴

高效液相色譜儀使用點滴二、WatersHPLC2695分離單元使用操作/dvbbs/dispbbs.asp?boardID=151&ID=87627&page=11、 開機自檢打開電源開關，儀器開始自檢(4?5min)，待屏幕上方出現(xiàn)“Idle”字樣表示自檢成功。2、 脫氣(Degas)按面板右下方“MenUStatus”鍵進入“Status(1)”界面，移動光標至“DegasserMode"，按Enter選擇“On”，打開在線脫氣。注意：自動脫氣機？在開啟除氣裝置時，要確認所有溶劑管路都充滿溶劑；若沒有溶劑時請執(zhí)行溶劑的DryPrime動作。當溶劑流速為0.0時，一定要關閉除氣裝置，不然可能會過度真空使除氣槽(vacuumchamber)破裂，而造成移動相外流出來.當溶劑的管子是空的時候，或是更換溶劑的時候，先執(zhí)行DryPrime。按“MenUStatus”鍵，進入Status(1)畫面，按“DirectFunction”功能鍵，選擇DryPrime，按Enter。冬天脫氣時，室溫應大于10°C。3、 設定柱溫(可選項)

在“Status（1）”界面，移動光標至“ColHtrSet”，輸入目標溫度按Enter即可（可在工作站方法中設置）。注意：設定溫度應高于室溫5°C低于60°C。4、 PrimeSealWash（清洗柱塞桿）按“Menu/Status”鍵回到“Menu”界面，按下排功能鍵“Diag”，然后再按下排功能鍵“PrimeSealWsh”，按'Start”鍵，沖洗1?2min后，先按“HALT”鍵，再按“CLOSE”鍵，結束柱塞桿的清洗。注意：（1）清洗柱塞桿的溶劑可以用水，或5%-10%甲醇（抑菌）。（2）可以每天開機后進行，或結束實驗時進行。流動相中有鹽，結束實驗時一定要清洗，儀器不自動進行。5、 WetPrime在“Status（1）”界面中"Composition”下，選擇將用到的溶劑通道為“100%”，按液晶屏幕右下角“DirectFunction”鍵，移動光標選擇“2WetPrime”，“OK”，流速及時間可使用默認值，也可自行設定（如：5ml/min，3min），“OK”即可。將每一個會用到的溶劑通道按照上述操作一次。6、 PurgeInjector（注射器排氣泡及清洗）進入“DirectFunction”界面后，選擇“3PurgeInjector”，“OK”，默認數(shù)值為6，“OK”。7、 PrimeNeedleWash（清洗注射針）

按“Menu/Status”鍵回到“Menu”界面，按下排功能鍵“Diag”，進入“Diagnostics”界面，按下排功能鍵之“PrimeNdlWsh”，按“Start”鍵，默認30秒鐘，按“Close”鍵，即可返回“Diagnostics”界面。注意：以上4~7操作步驟為溶劑系統(tǒng)前處理過程，建議每天開機后依次進行。若發(fā)現(xiàn)注射器中有氣泡，則可重復6的操作步驟直至排除。如果流動相中含有鹽類，則實驗結束后必須用水清洗柱塞桿??(即操作4)。8、 平衡柱子在“Status(1)”界面上，按流動相比例設定各通道溶劑比例后，再WetPrime操作一次，然后設置流速，平衡色譜柱30~60min。9、 放置樣品拉開樣品轉盤艙門，將盛有待測樣品溶液的樣品瓶放入轉盤中,記下樣品瓶號，關上艙門。10、 檢測樣品打開工作站，設置儀器方法、方法組、自動進樣序列等，監(jiān)視基線、檢測樣品。11、 分析處理數(shù)據(jù)、打印報告12、 清洗注射器、針、柱塞桿參見上述4、7的操作步驟。

13、 清洗色譜柱用水沖洗柱子40-60min（視柱子規(guī)格不同，流速通常1ml/min）；然后用甲醇或乙腈沖洗柱子40min（流速1ml/min）。14、 關機關掉電源開關。氨基柱是同時可以用于正相條件和反相條件的，http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardID=148&ID=29087&page=l這一點很多用戶都已經知道；但是要注意到的是：正相溶劑和反相溶劑往往是不互溶的，對這一點的忽略可能會帶給使用者一些麻煩。對于新購買到的柱子，首先請注意打開分析測試說明書，了解柱子的保存溶劑。如果保存溶劑與你將要使用的流動相極性不同不會互溶，請先用異丙醇過渡。過渡過程中注意因異丙醇粘度較大，會導致柱壓很高，適當調低流速即可。如果要使用的流動相中還含有緩沖鹽類，建議在用分析流動相之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，這樣可避免緩沖鹽在分析柱內的析出。柱效檢測：我用于判斷一個用戶是否有經驗的指標之一，是用戶是否習慣配制一些柱效檢測標準溶液。說到柱效檢測，我可以向大家提供一個方法，而且很通用，你也可以用同樣的標準溶液和流動相來檢測硅膠柱和氰基柱。流動相：10%乙酸乙酯+90%正己烷流速1.0標準溶液：乙苯（如乙苯找不動就用甲苯代替唄）+苯甲酸甲酯檢測波長254nm這個方法特別適用于新購柱子（新購柱子往往保存在正相溶劑中）時即進行檢測，如有問題，可及時與供應商溝通。也適合在柱子在準備放置相當長一段時間之前進行充分清洗后進行檢測作為記錄留檔。在平常的使用過程中，如果分析物是固定重復的，我們當然可以從對分析物的分離分析情況來作出判斷；但如果分析物和分析條件不同時，定期檢測柱效可以避免柱效下降導致分離不佳再分析查找原因這樣浪費人力物力的過程。不過特別要注意的是，當氨基柱（或氰基柱）在反相條件中使用時，如用該條件檢測，請注意流動相的換相過渡問題。氨基柱的使用：需要注意的是，氨基柱的鍵合官能團氨丙基要比C18,C8柱的鍵合官能團C18,C8要容易水解，所以首先要做好其使用壽命稍遜的心理準備，特別是當你的使用條件是反相條件下時。反相條件下使用時，要特別注意控制PH值范圍，PH值越低越有發(fā)生水解的危險，流動相中水的比例越高當然也越有發(fā)生水解的危險。所以，在使用后以及準備長時間放置該柱時，必要的清洗和將氨基柱保存于純的有機溶劑中是很好的保養(yǎng)措施。有一種情況是，當使用氨基柱進行酸性物質如果汁的分析時（分析其中的糖份），酸性物質的存在意味著質子的存在，可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化，導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。這時，Kromasil專家所給的建議是：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的50-50乙腈-水溶液沖洗該柱（沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨），之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%。氨基柱的清洗簡單說起來，正相條件下使用的氨基柱你就參照硅膠柱的清洗方法；反相條件下使用的氨基柱你就參照C18的清洗方法。平時在正相條件下使用：首先用50倍柱體積的異丙醇清洗，因異丙醇粘度較大可適當放低流速；之后，用50倍的甲醇清洗；之后，用異丙醇過渡回到平常使用的正相流動相，即可。平時在反相條件下使用：緩沖鹽應及時沖洗，以及不能直接用純甲醇沖

洗緩沖鹽等，屬常識就不作特別交待了。用50倍純甲醇沖洗；之后，用異丙醇過渡后，用二氯甲烷沖洗色譜柱；之后，再用異丙醇過渡回來到甲醇條件下。這些清洗方法，主要是針對當樣品中有雜質逐步吸附累積到填料上時的處理方法，色譜柱表現(xiàn)行為為諸如柱壓增高柱效降低等LUNA氨基柱的使用方法氨基柱既可以正相使用，也可以反相使用，但是要注意到的是：正相溶劑和反相溶劑往往是不互溶的，正常情況新氨基柱保存在正相環(huán)境中，例如LUNA氨基柱保存在正己烷-乙腈（99：1）中。正相使用2.1新柱子可直接用流動相。推薦先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速沖10倍柱體積，再根據(jù)流動相選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速沖10倍柱體積，最后換成流動相。2.1正相使用時，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于還原糖的分析；流動相要徹底脫氣，并不得含有羰基化合物和過氧化物（質量不好的yi醚、四氫咲喃含有少量）。2.3任何時候更換流動相時都要確保新流動相與柱子原保存液可互溶。3反相使用3.1先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速沖10倍柱體積，再依次以相同的流速相同的用量用氯仿、異丙醇、甲醇、甲醇-水（50：50）沖柱子。3.2以0.5ml/min的流速用30倍柱體積的pH11.0的氫氧化鈉（LUNA）水溶液沖柱子（注意pH值切不可超過11.0），立即用水（0.5ml/min的流速，30倍柱體積）沖洗，再換成流動相。3.3配制流動相時，應各組分分別量取，比例較小的組分要精密量取，需調pH值時要精密到0.1。3.4反相條件下使用時，要特別注意控制pH值范圍，pH值越低越有發(fā)生水解的危險，流動相中水的比例越高當然也越有發(fā)生水解的危險。最理想的pH范圍在pH3.0-7.03.5如果要使用的流動相中還含有緩沖鹽類，建議在用分析流動相之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，這樣可避免緩沖鹽在分析柱內的析出。3.6有一種情況是，當使用氨基柱進行酸性物質的分析時，酸性物質的存在意味著質子的存在，可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化，導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。建議：用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水（50:50）溶液沖洗該柱（沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨），之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%。4色譜柱的沖洗：簡單說起來，正相條件下使用的氨基柱就參照硅膠柱的清洗方法；反相條件下使用的氨基柱就參照C18的清洗方法。5色譜柱的保存5.1正相使用時，將柱子沖洗干凈后，用正己烷-乙腈（99：1）保存。5.2反相使用時，如短期不用，可用甲醇或乙腈保存；長期不用時需將甲醇依次用異丙醇、氯仿置換，最后用正己烷保存。6色譜柱的再生6.1方案1：依次用甲醇、異丙醇、氯仿、正己烷、氯仿、異丙醇、甲醇沖柱子（各以0.5ml/min的流速，20倍柱體積），再換流動相。這些清洗方法，主要是針對當樣品中有雜質逐步吸附累積到填料上時的處理方法，色譜柱表現(xiàn)行為為諸如柱壓增高柱效降低等。6.2方案2：NH2柱用于反相條件時，NH2鍵會水解，尤其是在該柱子pH范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱壽命會下降很快，如果在這個條件下使用需要清洗一下，需要用10倍柱體積溶液沖洗，如下：95%水/5%乙腈THF四氫咲喃95%乙腈/5%水并保持95%乙腈/5%水繼續(xù)沖洗，以低流速0.2-0.5mL/min過夜沖洗。

6.3方案3：柱子使用一定時間后，柱效下降，老化，也可清洗一下柱子恢復柱性能清洗時依次用10倍柱體積的下列溶液沖洗：95%水/5%乙腈THF四氫咲喃95%乙腈/5%水再走流動相即可2695運行過程中，兩種流動相切換過程中壓力忽高忽低，是怎么回事？http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardID=151&ID=106954&page=l切換流動相的時候先wetprime一下，如果還是不行可能是單向閥的問題兩種流動相能混溶嗎？？可能有氣泡生成應該是汽泡問題，dryprime一下吧。dryprime,這種叫做干排法！就是說管路里已經沒有液體拉，也就是說管路里完全都是氣泡，會選擇這個。這種方法會讓液體慢慢的充滿整個管路！wetprime，這種叫做濕排！就是說管路里有液體，但是其間有氣泡，這個情況下會選擇這種方法！/showtopic-13664.html秘訣1：由強到弱：一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據(jù)出峰情況調整有機溶劑（乙腈或甲醇）的比例。秘訣2三倍規(guī)則：每減少10%的有機溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。秘訣3粗調轉微調：當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。最小檢測限的計算方法（以N2000色譜工作站為例）/showtopic-23303.htmlCL=2*Nd*c*20/HV注：Nd基線噪聲，單位：mVc樣品濃度H峰高，單位：mV（或AU）V進樣體積例：如基線噪聲為20微伏即0.02mV,萘的甲醇標樣溶液濃度為0.0001g/L,峰高145000微伏即145mV，進樣體積為20微升，即得：CL=2*0.02*0.0001*20/145*20=2.76e-8即10的負8次方HPLC系統(tǒng)的酸清洗和鈍化/showtopic-29179.html1、30％磷酸水溶液30％磷酸水溶液通過酸反應和強表面活性劑／洗滌劑的共同作用，可以有效地清潔不銹鋼及其它潤濕的部件。這一方法比更常用的硝酸“鈍化”絕對更有效、且較少損害（特別是對日常使用低紫外波長的應用來說）。這一磷酸清洗步驟不是起鈍化作用，但它是系統(tǒng)鈍化前清洗的第一步。一般來說，對于陽離子的離子色譜分析或配有氧化方式的電化學檢測器以外的應用不需要鈍化系統(tǒng)。因為有真空脫氣機（每個通道體積為8m1），可不必用磷酸；中洗全部通道。如果你計劃四個通道都要用，則可用濕灌注的方式以4mL/min流速對每個通道清洗8?1O分鐘來清洗脫氣機。這一步完成后你必須徹底淋洗管路，用水淋洗2?3次以便將磷酸從溶劑過濾頭等部件沖洗凈。安裝好的HPLC系統(tǒng)的酸清洗和鈍化HPLC系統(tǒng)內部可能的污染物來自人的觸摸，暴露在實驗室化學環(huán)境，與零部件制造相關的殘留物，或來自先前的流動相和樣品的殘余物。雖然系統(tǒng)自身也會逐步地被流動相清洗，但某些釋放出的雜質會吸附在色譜柱上以及檢測器潤濕的表面上，因而會降低總的性能。磷酸清洗：通常用于從系統(tǒng)中除去有機雜質?？赡苁怯捎谙礈熳饔茫坪醣葟娪袡C溶劑更好也更快。這一步清洗必須在硝酸鈍化之前完成。硝酸鈍化：實際上是作用于不銹鋼表面，在表面上生成均勻的氧化層。這層氧化膜保護不銹鋼免受腐蝕（鹵化物，螯合劑，等等）并且盡量減少浸出的金屬離子進入流動相。以下應用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸鈍化，包括：所有的氨基酸分析系統(tǒng)；所有包含電化學檢測器的系統(tǒng)；所有要分析無機陽離子，包括過渡金屬的系統(tǒng)；所有利用柱后添加衍生試劑或絡合樣品組分的系統(tǒng)。以下應用需要在使用前只做磷酸清洗，包括：①所有常規(guī)用途的、可能在低pH環(huán)境下在