實驗二 還原糖及總糖的測定

實驗二還原糖及總糖的測定（3、5——二硝水楊酸比色法）目的和要求：1．掌握3、5-二硝基水楊酸比色法測定糖量的原理及方法。2．熟悉722分光光度計基本工作原理和操作方法。原理：各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖徹底水解成有還原性的單糖。在堿性條件下，還原糖與3、5—二硝基水楊酸共熱，3、5—二硝基水楊酸被還原為3-氨基-5-硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸及其它物質(zhì)。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定的比例關(guān)系，可在分光光度計540nm波長測定棕紅色物質(zhì)的吸光值。查標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，便可分別求出樣品中還原糖和總糖的含量。多糖水解時，在單糖殘基上加了一分子水，因而在計算中須扣除已加入的水量，測得所得到的總糖量乘以0.9即為實際的總糖量。該方法是半微量定糖法，操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少。試劑和材料：1．試劑（1）1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100ml分析純葡萄糖（預(yù)先在105℃烘至恒重），置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100ml（2）3、5—二硝基水楊酸試劑（又稱DNS試劑）甲液——溶解6.9g結(jié)晶酚（苯酚）于15.2ml10%NaOH中，并稀釋至69ml，在此溶液中加入6.9g亞硫酸氫鈉。乙液——稱取22.5g酒石酸鉀鈉，加到300ml10%NaOH中，再加入880ml1%的3、5—二硝基水楊酸溶液。將甲液和乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中，放置7—10天使用。（3）碘—碘化鉀溶液（碘試劑）：稱取5g碘和10g碘化鉀，研勻后溶于100ml蒸餾水中。（4）酚酞指示劑：稱取0.1g酚酞溶于70%乙醇中。（5）6mol·L-1HCl（6）6mol·L-1NaOH（7）面粉2．器材比色管、離心管、量筒、三角瓶、容量瓶、刻度吸管、玻璃漏斗、濾紙、白瓷板、電熱恒溫水浴槽、離心機(jī)、天平、分光光度計。

操作步驟：1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支干燥試管，編號，按下表所示的量，精確濃度為1.00mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3、5—二硝基水楊酸試劑。管號加入試劑012345葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.40.60.81.01.2蒸餾水（ml）3.53.12.92.72.52.33、5—二硝基水楊酸試劑（ml）1.51.51.51.51.51.5總體積（ml）5.05.05.05.05.05.0將各管搖勻，帶上小漏斗，在沸水浴中加熱5min，立即用冷水冷卻至室溫，再向各管中加入蒸餾水20.0ml，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻。切勿用力振搖，引入氣泡。在540nm波長下，以0號管為空白，在分光光度計上測定1-5號管的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2．樣品中還原糖和總糖含量的測定(1)樣品中還原糖的提?。悍Q取2.00g左右在常溫下于干燥器內(nèi)保存數(shù)日的面粉，置于125ml三角瓶中，以少量水調(diào)成糊狀，再加入40ml蒸餾水，攪勻，置于50℃將上液倒入100ml容量瓶中，用少量的蒸餾水多次洗滌三角瓶內(nèi)殘留物，將所得的洗滌液全部收集于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻。取適量上液于離心管中，在3500轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘。上清液作為還原糖待測液。(2)樣品中總糖的水解和提?。悍Q取0.80g左右同樣的面粉，置于125ml三角瓶中，加入15ml蒸餾水，10ml6mol·L-1的HCl，在沸水浴中加熱30min。用滴管取1-2滴于白瓷板上，加1滴碘-將瓶中水解液冷卻，加入1滴0.1%的酚酞指示劑，用6mol·L-1NaOH中和至微紅色。然后將上溶液倒入100ml容量瓶中，并用少量的蒸餾水多次洗滌三角瓶內(nèi)的殘留物，將所得的洗滌液全部收集于100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻。取適量上液于離心管中，在3500轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘(或過濾于干燥的三角瓶中，棄去前幾毫升濾液，得濾液約15ml)；準(zhǔn)確吸取其上清液10.0ml，再定容至100ml，作為總糖的待測液。取5支干燥試管，編號，按下表所示的量，精確加入待測液和試劑：管號項目空白還原糖總糖01245樣品量（ml）02.02.01.01.0蒸餾水（ml）3.51.51.52.52.53、5—二硝基水楊酸(ml）1.51.51.51.51.5總體積（ml）5.05.05.05.05.0加完試劑后，其余操作步驟與制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時的相同，測定出各管溶液的吸光值。計算：以管1、2、3的吸光值的平均值和管4、5、6的吸光值的平均值，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計算樣品中還原糖和總糖的百分含量：提取液總體積標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的還原糖提取液總體積標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的還原糖毫克數(shù)×測定時取用體積測定時取用體積樣品毫克數(shù)還原糖%=樣品毫克數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的還原糖毫克數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的還原糖毫克數(shù)×稀釋倍數(shù)樣品毫克數(shù)總糖%=