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/北京化工大學(xué)課程論文題目宏基因組學(xué)中的酶資源挖掘及其催化性能改良策略姓名王澳克班級(jí)生研1505日期:2015年12月10日論文正文課程心得附錄1:中文PPT附錄2:英文PPT宏基因組學(xué)中的酶資源挖掘及其催化性能改良策略摘要:酶催化在食品、醫(yī)藥、化工、能源等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。開發(fā)新型微生物酶資源,對(duì)酶進(jìn)行修飾改良,是酶催化領(lǐng)域的重要研發(fā)內(nèi)容。極端微生物和不可培養(yǎng)微生物酶的發(fā)掘是獲取新型工業(yè)催化劑的熱點(diǎn);體外定向進(jìn)化、雜合酶、表面展示等蛋白質(zhì)工程等分子生物學(xué)技術(shù)手段為開發(fā)特定性質(zhì)“新酶”提供了有力工具;生物印跡、pH記憶、定向固定化、交聯(lián)酶晶體、脂質(zhì)體包埋等高效物理化學(xué)修飾方法拓寬了酶原有的催化性質(zhì)。微生物酶資源挖掘及其改良將推動(dòng)酶的生物催化產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。關(guān)鍵詞:酶;宏基因組;定向進(jìn)化;生物印跡微生物蘊(yùn)藏著大量具有工業(yè)應(yīng)用潛力的生物催化劑。然而,傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只能從環(huán)境中獲得不到1%的微生物。作為生物催化劑的微生物酶,由于其高度的化學(xué)底物選擇性、區(qū)域選擇性、對(duì)映體選擇性1],能高效完成天然和非天然底物的專一性催化反應(yīng);在得到高品質(zhì)產(chǎn)品的同時(shí),對(duì)環(huán)境友好,有著傳統(tǒng)化學(xué)催化劑不可比擬的優(yōu)勢,因而是“綠色化學(xué)”倡導(dǎo)的優(yōu)良工業(yè)催化劑。以高附加值手性化合物為代表的生物催化已成為各大生物技術(shù)公司和化學(xué)公司競相研發(fā)的熱點(diǎn)[2]。開發(fā)高活性、高選擇性和高穩(wěn)定性的酶,是實(shí)現(xiàn)綠色化工,合成重要化工和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要保障。自然界中尚未充分發(fā)掘的微生物資源為新型酶的獲得提供了寶貴的酶源,發(fā)掘潛在的微生物及其基因資源是當(dāng)前的重要方向,是生物催化的重要基礎(chǔ);運(yùn)用生物學(xué)、物理化學(xué)方法對(duì)現(xiàn)有酶進(jìn)行修飾改造,獲得優(yōu)異性能的工業(yè)催化用酶,是生物催化的關(guān)鍵。宏基因組學(xué)是通過提取某一特定環(huán)境中的所有微生物基因組DNA、構(gòu)建基因組文庫并對(duì)文庫進(jìn)行篩選,尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因的一種方法。它繞過了微生物分離培養(yǎng)過程,成為研究環(huán)境樣品中不可培養(yǎng)微生物的有力手段。1宏基因組學(xué)宏基因組學(xué)起源于上世紀(jì)70年代土壤微生物基因組DNA的研究,近年來研究者們已利用宏基因組文庫技術(shù)從不同環(huán)境樣品中篩選到了脂肪酶/酯酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等多種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的生物催化劑。隨著宏基因組學(xué)在挖掘新型生物催化劑中的廣泛使用,我們進(jìn)入了宏基因組學(xué)挖掘生物催化劑的時(shí)代[3]。1.1宏基因組文庫的樣品來源目前,宏基因組學(xué)研究的樣品主要來源于土壤環(huán)境和海洋環(huán)境。這是因?yàn)橥寥谰哂形⑸镞M(jìn)行生長繁殖和生命活動(dòng)所需的各種條件,是微生物生活的最適宜環(huán)境。據(jù)估計(jì),每克土壤中含有高達(dá)10000種不同的微生物[4],這表明土壤微生物宏基因組是一個(gè)巨大的基因資源庫,對(duì)它們的挖掘能夠獲得大量的生物酶制劑;而海洋環(huán)境在壓力、鹽分、溫度和營養(yǎng)成分上的極端變化賦予了海洋微生物在物種資源、基因功能和生態(tài)功能上無與倫比的生物多樣性。為了獲得性能更加多樣的生物催化劑,研究者們需要廣泛地采集環(huán)境樣品,特別是一些極端環(huán)境中的樣品。1.2宏基因組DNA的提取宏基因組DNA的提取是構(gòu)建宏基因組文庫的關(guān)鍵步驟,因?yàn)榄h(huán)境樣品總DNA的濃度、純度、片段大小和偏好性等因素將直接影響宏基因組文庫的質(zhì)量和代表性。DNA提取方法大體可分為兩類:直接提取法和間接提取法。直接提取法,又稱原位裂解法,這類方法是通過物理法、化學(xué)法或酶解法直接裂解環(huán)境樣品中微生物的細(xì)胞壁來提取DNA并加以純化。目前常用的裂解方法中,物理法有反復(fù)凍融法、超聲法、玻璃珠擊打法、液氮碾磨法等;化學(xué)法所采用的化學(xué)試劑有表面活性劑(如SDS)、鹽類、有機(jī)溶劑等;酶解法則主要采用溶菌酶和蛋白酶。不同裂解法的差別在于細(xì)胞破壁的方式不同。直接提取法無需對(duì)環(huán)境樣品中的微生物進(jìn)行復(fù)蘇處理,操作簡便,且樣品中的微生物能夠被裂解得比較完全,故DNA提取得率高,所獲得的基因組DNA能較好地反映樣品中微生物種群的多樣性。但由于操作過程中機(jī)械剪切力大,導(dǎo)致所獲得的DNA片段較?。?~50kb),且多為平端;此外,由于提取的基因組DNA中混有金屬離子、腐殖酸、多糖、多酚化合物等雜質(zhì),純度較低,往往還需要經(jīng)過純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作(如DNA酶切、PCR擴(kuò)增)的需要。該法提取的DNA主要適用于以質(zhì)粒或λ噬菌體為載體的小片段文庫的構(gòu)建。間接提取法,又稱異位裂解法,是利用梯度離心或者差速離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來,然后再用比較溫和的方法提取基因組DNA。該方法受土壤中雜質(zhì)的污染較小,提取條件比較溫和,所獲得的DNA純度較高,片段大(20~500kb),適合于構(gòu)建以柯斯粘粒(Cosmid)和細(xì)菌人工染色體(Bacterialartificialchromosome,BAC)為載體的大片段文庫;但該方法操作繁瑣,前分離過程會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的丟失,加上溫和條件下細(xì)胞壁較厚的微生物不易被裂解,因此所獲得的DNA中基因組信息的廣泛性不及原位裂解法,得率只有原位裂解法的1%~10%。隨著宏基因組學(xué)的發(fā)展,許多新的DNA提取技術(shù)不斷被提出,使得人們可以從各種各樣的環(huán)境樣品中獲得高質(zhì)量的總DNA。然而,并沒有一種標(biāo)準(zhǔn)的或通用的環(huán)境DNA提取方法。任何DNA提取方法都存在一定的偏好性,導(dǎo)致選擇性地富集某些微生物的DNA,同時(shí)選擇性地遺漏某些微生物的DNA,從而影響所提取的DNA的種群覆蓋率。在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)根據(jù)所研究生境的特性和研究目的進(jìn)行選擇和優(yōu)化。1.3宏基因組文庫的構(gòu)建1.3.1載體的選擇載體在宏基因組技術(shù)中具有重要地位,常用載體有質(zhì)粒(Plasmid)、細(xì)菌人工染色體(BAC)、柯斯粘粒(Cosmid)、福斯黏粒(Fosmid)等。載體的選擇應(yīng)考慮以下因素:研究目的、所提取的環(huán)境總DNA的質(zhì)量、欲插入目的片段的最大長度、所需要的載體拷貝數(shù)、欲采用的宿主以及篩選策略[5][6]。1.3.2宿主的選擇宿主的選擇應(yīng)考慮以下因素:所選擇的載體類型,宿主的轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、宿主能否為相關(guān)功能基因提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系、對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物是否有較強(qiáng)的相容性、以及目標(biāo)性狀(如抗菌性)缺陷型等。目前,構(gòu)建用于篩選新酶的宏基因組文庫時(shí),最常用的宿主為大腸桿菌E.coli。1.4目標(biāo)克隆的篩選由于環(huán)境樣品中微生物種類眾多,文庫容量龐大,如何有效得到目標(biāo)克隆,是研究者們必須解決的一個(gè)難題。目前,從宏基因組文庫中篩選新型生物催化劑的策略可分為3種:基于活性的篩選,基于序列的篩選和底物誘導(dǎo)的篩選。2酶資源挖掘2.1極端微生物酶極端微生物及其產(chǎn)生的酶類不僅為生物科學(xué)提供基礎(chǔ)研究素材[5],而且對(duì)苛刻條件下的工業(yè)生物催化過程有積極的實(shí)踐意義。由于極端微生物培養(yǎng)條件苛刻,可以采用重組DNA技術(shù)在常規(guī)宿主中表達(dá)極端酶,從而避開極端菌的直接培養(yǎng)。嗜熱耐堿的酶T1在以pGEX為載體,以EscherichiacoliBL21(De3)為宿主的原核表達(dá)系統(tǒng)中得以可溶性表達(dá)[6]。通過酶GST標(biāo)簽的親和層析純化得到純酶。其最適溫度70℃,最適pH9.0。在65℃以下很穩(wěn)定,在pH9.0時(shí)半衰期為5.25h。該酶可應(yīng)用到食品工業(yè)中脂肪酸的生產(chǎn),因?yàn)樽貦坝秃团V仍诔叵聻楣虘B(tài),只有在較高的溫度下才能呈液態(tài),發(fā)生反應(yīng);而常規(guī)微生物酶在較高的溫度下易失活。2.2不可培養(yǎng)微生物酶特定生境中只有一小部分微生物可用實(shí)驗(yàn)方法分離培養(yǎng),占絕大多數(shù)的不可培養(yǎng)微生物(unculturedmicroorganism)是地球上尚未開發(fā)的巨大資源[7]。宏基因組(metagenome)技術(shù)繞過純培養(yǎng)步驟,直接從生境樣品中獲取遺傳信息,提供更加全面的基因資源,從而有效地提高了新酶的篩選效率。采用宏基因組技術(shù)篩選酶有兩種途徑-功能篩選和序列篩選。功能篩選途徑即把來源于不可培養(yǎng)微生物的DNA克隆到大腸桿菌質(zhì)粒中,構(gòu)建宏基因組文庫,然后基于酶活性篩選獲得微生物酶基因。序列篩選途徑以酶三聯(lián)體活性中心(Ser-Asp-His)和氧陰離子洞(oxyanionhole)區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)引物,以環(huán)境基因組DNA為模板,擴(kuò)增酶基因片段,然后用基因組步查(genomic-walking)的方法克隆出全長酶基因。3酶催化性能改良策略3.1定向進(jìn)化酶對(duì)酶分子的改造,一是基于序列的合理化設(shè)計(jì)方案(sequentialrationdesign),如化學(xué)修飾、定點(diǎn)突變(site-directedmutagenesis)等;二是利用基因的可操作性,模擬自然界進(jìn)化過程的非合理設(shè)計(jì)方案(irrationaldesign),如定向進(jìn)化(directedevolution)、雜合進(jìn)化(hybriddevolution)等[8]。酶分子的定向進(jìn)化無需了解酶的結(jié)構(gòu)功能和催化機(jī)制等方面的信息,人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件,模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、基因重組和自然選擇),在體外改造酶基因,并定向篩選出所需性質(zhì)的突變酶。酶的定向進(jìn)化即是通過基因突變、基因表達(dá)和高通量篩選技術(shù)獲得預(yù)期性質(zhì)的突變酶,如提高酶活力、提高穩(wěn)定性、提高底物專一性和提高對(duì)映體選擇性等。酶的定向進(jìn)化尤以提高對(duì)映體選擇性研究得最多。3.2雜合酶雜合酶是指把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或使整個(gè)分子進(jìn)行組合和交換,產(chǎn)生酶雜合體,以改進(jìn)或創(chuàng)造酶的某種功能[9]。雜合酶的構(gòu)建也為酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系研究提供了模型。通過定向組合,將白地霉酶ⅠN末端序列和白地霉酶ⅡC末端序列在不同的位點(diǎn)融合,構(gòu)建一系列雜合酶。以三油酸甘油酯和三辛酸甘油酯作為模式底物,對(duì)雜合酶的底物特異性酶活力進(jìn)行測定,確定酶分子上影響底物結(jié)合和催化的序列。研究結(jié)果表明決定白地霉酶Ⅰ對(duì)油酸甘油酯特異性的序列位為349~406的58個(gè)氨基酸。該區(qū)段氨基酸的置換顯著地改變了對(duì)短鏈脂肪酸底物(三辛酸甘油酯)的活力。同時(shí),最終優(yōu)化的雜合酶選擇性水解外消旋癸酸甲酯的對(duì)映選擇率比天然的酶Ⅰ和Ⅱ都要高。利用進(jìn)化手段較容易構(gòu)建出高度多樣性的突變基因庫,酶的有利功能突變體常被埋沒在眾多的中性突變和不利突變?nèi)褐?,因此建立高效的、有針?duì)性的高通量篩選體系是定向(雜合)進(jìn)化最具挑戰(zhàn)性的內(nèi)容。3.3表面展示酶表面展示技術(shù)借助錨定載體,將外源蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌體、細(xì)菌或酵母的表面,使其保持相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象和原有的生物活性[10]。不同酶的底物特異性不一樣。利用共展示技術(shù),在同一宿主上同時(shí)展示兩種酶,可以擴(kuò)大其催化的底物譜,更好地發(fā)揮其生物催化作用。Kobayashi等[11]以CWB(cellwall-bindingdomain)為錨定蛋白,在B.subtdis宿主上同時(shí)展示了B.subtdis酶B。以INP蛋白(ice-nucleationprotein)為錨定蛋白,通過INP–TliA融合蛋白的方式在大腸桿菌表面成功展示了嗜熱酶(TliA)。該展示的新型“固定化”酶,可高效催化非水相體系中橄欖油的水解反應(yīng)。表面(共)展示技術(shù)開辟了表面催化劑的新領(lǐng)地,是未來重點(diǎn)發(fā)展的催化劑,其瓶頸在于高效、兼容性好的錨定載體的篩選。高效載體的開發(fā)必將推動(dòng)表面催化工程快速發(fā)展。3.4生物印跡酶根據(jù)酶在有機(jī)溶劑中具有“剛性”結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),利用酶與印跡分子的相互作用,誘導(dǎo)、改變酶的構(gòu)象,制備具有結(jié)合該印跡分子及其類似物能力的“新酶”,是修飾改造酶的一種方法。水溶性酶在通常狀況下,活性位點(diǎn)被“蓋子”結(jié)構(gòu)覆蓋,呈非活性狀態(tài)。當(dāng)?shù)孜锛捌漕愃莆锝閷?dǎo)的油水界面產(chǎn)生時(shí),蓋子打開,呈活性狀態(tài)。為了獲得高效非水相酶,選擇適當(dāng)兩親性的表面活性劑或底物類似物作為印跡分子,待印跡分子與酶充分印跡接觸后,將印跡分子-酶復(fù)合物冷凍干燥,用非水溶劑洗脫印跡分子,形成了活性中心開啟的印跡酶,并且這種狀態(tài)在有機(jī)溶劑的剛性環(huán)境里仍能維持。選擇不同結(jié)構(gòu)的印跡分子誘導(dǎo),會(huì)產(chǎn)生結(jié)合部位構(gòu)象不同的印跡酶,適應(yīng)不同的底物,從而催化活力比非印跡酶顯著提高。印跡酶的催化活力依賴于酶類別、有機(jī)溶劑和印跡分子本身。3.5pH記憶酶有機(jī)溶劑中酶分子表面的必需水只有在特定的pH和離子強(qiáng)度下,才能使酶分子活性中心周圍的基團(tuán)處于最佳的離子化狀態(tài),從而有利于酶活性的表現(xiàn)。所以有機(jī)溶劑中的酶活力與酶冷凍干燥或有機(jī)溶劑沉淀前所在的緩沖掖的pH和離子強(qiáng)度密切相關(guān),其最適pH與水相中酶的最適pH是一致的。當(dāng)酶分子從水溶液轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中時(shí),它保持了原有的離子化狀態(tài)。利用酶的pH記憶特性可以提高有機(jī)相中酶催化活力。對(duì)于生物印跡、pH記憶修飾型酶,不夠透徹的“印跡”和“記憶”分子機(jī)理及其僅能在有機(jī)溶劑中起催化作用制約了其進(jìn)一步的發(fā)展與應(yīng)用。因此闡明酶分子構(gòu)象誘導(dǎo)的細(xì)微變化與酶催化活性的關(guān)系,研究不同印跡分子對(duì)酶活性的影響,開發(fā)以水不溶性底物為代表的新型印跡分子,突破印跡酶、記憶酶僅在有機(jī)介質(zhì)中起催化活性作用的局限,進(jìn)而開發(fā)水相印跡酶、記憶酶,是大勢所趨。3.6脂質(zhì)體包埋酶酶粉雖然在非水介質(zhì)中能夠催化反應(yīng),但是其催化效率比水溶液中的酶低幾個(gè)數(shù)量級(jí),其中原因之一是酶一般難溶于有機(jī)溶劑。雖然有些酶能直接溶解在少數(shù)有機(jī)溶劑中.但是酶催化效率常常很低。雙親分子共價(jià)或非共價(jià)修飾酶分子表面,可以增加酶表面的疏水性,使酶均一地溶于有機(jī)溶劑,提高酶的催化效率。增加水溶性酶在疏水性有機(jī)介質(zhì)中的溶解性可顯著提高酶的催化效率。通過混合酶和脂溶液,收集并冷凍干燥所得沉淀即得脂質(zhì)體包埋酶。脂質(zhì)體包埋酶不溶于水溶液但能很好地溶解于有機(jī)溶劑,如苯、乙酸乙酯、異辛烷、異丙醚、二甲基亞砜(DMSO)和乙醇等。脂分子親水頭與酶分子親水表面相互作用集結(jié)在一起,而脂分子的疏水烴基端延伸到疏水有機(jī)溶劑中,增加了酶的溶解性。一個(gè)酶分子約可以吸附100~200個(gè)脂分子,酶蛋白含量約占8%~10%。經(jīng)脂質(zhì)體修飾的Pseudomonasfragi酶催化(R,S)-苯乙醇與月桂酸的酯化反應(yīng),在2h內(nèi)能催化R-苯乙醇全部轉(zhuǎn)化成酯,而S-苯乙醇幾乎不反應(yīng)。脂質(zhì)體包埋技術(shù)面臨的主要問題是包埋材料的附著穩(wěn)定性[14]。3.7交聯(lián)酶晶體交聯(lián)酶晶體(cross-linkedenzymecrystal,CLES)是固定化酶的延續(xù)和發(fā)展,是一種有發(fā)展?jié)摿Φ墓潭ɑ椒╗15]。酶結(jié)晶本身就是一個(gè)分離純化和固定化的過程,雙功能交聯(lián)劑戊二醛對(duì)酶微晶進(jìn)行交聯(lián),酶蛋白既是催化劑又是載體,它提供非常高的酶濃度,不存在傳質(zhì)阻礙。通常固定化酶中酶含量僅占5%左右,相同質(zhì)量的交聯(lián)酶晶體的催化活性比一般固定化酶要高很多。高純度的酶晶體催化劑具有超強(qiáng)穩(wěn)定性,可在有機(jī)溶劑、氣相、超臨界流體等非常規(guī)介質(zhì)中表現(xiàn)出高度立體選擇性。3.8定向固定化酶酶的定向固定化技術(shù)可以將酶分子表面特定區(qū)域的氨基酸直接或間接(通過某些化學(xué)試劑、空間手臂)與載體偶聯(lián),實(shí)現(xiàn)酶分子活性中心背向載體,從而有效地消除對(duì)大分子底物結(jié)合的空間障礙,提高催化效率[16]。在大多數(shù)情況下,影響酶活性中心的氨基酸殘基在固定化載體上的無序附著導(dǎo)致酶固定化后催化活性部分喪失。定向固定化可使酶蛋白以有序的方式附著于載體表面,減小無序態(tài)造成的酶蛋白結(jié)構(gòu)變形,使酶活力損失降低。定向固定化的核心技術(shù)是特異性載體的開發(fā),篩選與酶活性中心基團(tuán)親和力低的載體或?qū)d體基團(tuán)進(jìn)行定向修飾是該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展方向。4結(jié)語和展望生物催化劑作為生物催化和轉(zhuǎn)化的核心,尤其是酶正受到越來越廣泛和深入的研究開發(fā)。一方面,發(fā)掘潛在的微生物及其基因資源,利用基因重組表達(dá)和發(fā)酵技術(shù)大量制備酶;另一方面,利用蛋白質(zhì)工程手段、物理和化學(xué)方法對(duì)現(xiàn)有酶進(jìn)行修飾改造,以滿足生物催化的要求。嗜極微生物和不可培養(yǎng)微生物的酶,將會(huì)在工業(yè)生產(chǎn)中部分替代現(xiàn)有的酶或作為新行業(yè)的催化劑。隨著基因工程、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展,利用分子進(jìn)化等手段獲得最適特性的酶已經(jīng)越來越被重視。作為分子進(jìn)化的一個(gè)分支,酶的定向進(jìn)化(雜合酶)不僅能使酶進(jìn)化出單一優(yōu)良的非天然特性,還能使酶的兩個(gè)或多個(gè)特性疊加,產(chǎn)生具有多項(xiàng)優(yōu)良性能“集成”的新酶,極大地發(fā)展和豐富了生物催化劑來源。新型酶催化劑的獲得應(yīng)立足于明確的設(shè)計(jì)思路。參考文獻(xiàn):[1]WhangsukW,SungkeereeP,ThiengmagS,etal.GenecloningandcharacterizationofanovelhighlyorganicsolventtolerantlipasefromProteussp.SW1anditsapplicationforbiodieselproduction.[J].MolecularBiotechnology,2013,53(1):55-62.[2]JianLK,CasseBDF,HeusslerSP,etal.Industrialapplicationsofmicro/nanofabricationatSingaporeSynchrotronLightSource[C]JournalofPhysics:ConferenceSeries.IOPPublishing,2006:891-896.[3]ZhangR,RenJ,WangY,etal.IsolationandcharacterizationofanovelRhodococcusstrainwithswitchablecarbonylreductaseandpara-acetylphenolhydroxylaseactivities[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2013,40(1):11-20[4]NataliaI,TringeSG,KonstantinosL,etal.Acallforstandardizedclassificationofmetagenomeprojects.[J].EnvironmentalMicrobiology,2010,12(7):1803-1805(3).[5]王輝,李亞莉,蘇丹,等.宏基因組學(xué)在普洱茶微生物研究中的應(yīng)用[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào),2015,06期(06):2195-2200.[6]任春光,龍?jiān)拼?劉曼,等.宏基因組學(xué)在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代園藝,2015,(19).[7]SiddiquiKS,Cav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