DB21-T 3273-2020豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法

ICS11.220

B41

備案號(hào)：72805-2020DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3273—2020

豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株

TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別方法

ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfrom

gE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus

DB21/T3273—2020

前言

本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)GB/T1.1-2009的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行制定。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理。

本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心。

本標(biāo)準(zhǔn)起草人：蘭德松、顧貴波、周維、楊洺揚(yáng)、李可心、孫世宇、張健、劉賀、李旭、高原、丁

靜。

本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可以通過(guò)來(lái)電和來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，

我們將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。

歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽(yáng)市和平區(qū)太原北街2號(hào)），聯(lián)系電話/p>

標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（沈陽(yáng)市皇姑區(qū)寧山東路29號(hào)），聯(lián)系電話：

II

DB21/T3273—2020

豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量

PCR鑒別方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病毒（pseudorabiesvirus,PRV）野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan熒光PCR

檢測(cè)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬血液、組織臟器、精液、鼻腔拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物等材料中PRV核酸的檢測(cè)以及PRV

野毒株與gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鑒別檢測(cè)。

本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-2實(shí)驗(yàn)室）中進(jìn)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

gD糖蛋白D（glycoproteinD）

gE糖蛋白E（glycoproteinE）

PRV偽狂犬病病毒（pseudorabiesvirus）

4儀器和耗材

4.1儀器

熒光PCR儀、高速冷凍離心機(jī)（可控溫至4℃，離心速度可達(dá)12000r/min以上）、組織研磨儀

或研缽、自動(dòng)化核酸提取儀（如選用商品化核酸提取試劑盒）、PCR微量離心機(jī)、2℃～8℃普通冰箱、

-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低溫冰箱、移液器（量程0.1μL～2μL、2μL～20μL、20μL～

200μL）。

4.2耗材

無(wú)菌無(wú)DNA酶的1.5mL離心管、0.2mLPCR反應(yīng)管或八聯(lián)管或96孔反應(yīng)板、與移液器匹配的吸頭。

5試劑和材料

1

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5.1DNAzol?Reagent：商品化DNA提取試劑，2℃～8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取試劑

盒（如磁珠法核酸提取試劑），通常18℃～25℃保存。

5.2無(wú)水乙醇：-20℃普通冰箱中預(yù)冷。

5.375%乙醇：用無(wú)水乙醇和雙蒸水配制，-20℃普通冰箱中預(yù)冷。

5.4PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2），配制見(jiàn)附錄A。

5.58mmol/LNaOH溶液，配制見(jiàn)附錄A。

5.62×TaqManFastqPCRMasterMix：為商品化探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)專用試劑，包含反應(yīng)所需的緩

沖液、酶、dNTP、Mg+等的預(yù)混液，-20℃普通冰箱中保存，避免反復(fù)凍融。

5.7引物和TaqMan探針，序列見(jiàn)附錄B。

5.8陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照使用PRV野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物、Bartha-K61疫苗毒，陰性對(duì)照采用滅

菌雙蒸水或健康豬的組織材料。

5.9除非另有說(shuō)明，在檢測(cè)中所用的試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。

6樣品采集、處理和運(yùn)輸

6.1采樣前準(zhǔn)備

6.1.1采樣人員

參照NY/T541中第5.1條的要求。

6.1.2采樣工具和器材

參照NY/T541中第6.10.3條的要求。

6.2樣品采集

6.2.1血液：參照NY/T541中第6.1條中豬血液樣品采集的要求進(jìn)行，將采集的血液注入含1/10體積

4%EDTA溶液的無(wú)菌容器中，充分混勻，編號(hào)備檢。

6.2.2組織臟器：參照NY/T541中第6.2條和6.3條中的要求進(jìn)行，將采集的病死豬或剖殺豬主要臟器（腦

組織、三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)等）或活體采集的扁桃體裝入滅菌的15mL～50mL離心管中，

編號(hào)備檢；組織臟器使用組織研磨儀或研缽進(jìn)行處理后用于核酸提取。

6.2.3精液：參照NY/T541中第6.10.3條中的要求進(jìn)行。

6.2.4鼻腔拭子：參照NY/T541中第6.4條中的豬鼻腔拭子采集要求進(jìn)行，將拭子樣品放入PBS緩沖液（0.02

mol/LpH7.2）中，編號(hào)備檢。

6.2.5細(xì)胞培養(yǎng)物：細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，第3次解凍后，4℃4000g離心10min，取上清轉(zhuǎn)入新

的無(wú)菌無(wú)DNA酶的1.5mL離心管中，編號(hào)備用。

6.3樣品保存、包裝和廢棄物處理

參照NY/T541中第7條的要求。

2

DB21/T3273—2020

6.4樣品運(yùn)輸

參照NY/T541中第9條的要求。

7熒光qPCR操作程序

7.1DNA提取

在實(shí)驗(yàn)室的核酸提取區(qū)進(jìn)行。

7.1.1DNAzol手工提取

7.1.1.1取n個(gè)無(wú)菌無(wú)DNA酶的1.5mL離心管，n為待檢樣品數(shù)+陽(yáng)性對(duì)照+陰性對(duì)照，對(duì)每個(gè)離心管進(jìn)行

編號(hào)。

7.1.1.2每管加入800μLDNAzol，分別加入被檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各200μL，顛倒混勻，室

溫靜置5min；4℃10000g離心10min。

7.1.1.3取900μL上清，轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌無(wú)DNA酶1.5mL離心管中，加入500μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，顛倒

混勻，室溫放置3min；4℃10000g離心5min。

7.1.1.4棄上清，沿管壁緩慢加入1mL-20℃普通冰箱中預(yù)冷的75%乙醇，顛倒混勻，4℃10000g離

心5min。重復(fù)洗滌2次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干或用移液器小心移去殘液。

7.1.1.5用50μL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，DNA在-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

7.1.2核酸提取儀提取

7.1.2.1按照與核酸提取儀匹配的核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取。

7.1.2.2將提取的DNA轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌無(wú)DNA酶的1.5mL離心管中，在-20℃以下普通冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

7.2熒光qPCR檢測(cè)

7.2.1反應(yīng)體系的配制和分裝

在試劑配制區(qū)進(jìn)行。gD基因和gE基因的反應(yīng)體系相同。設(shè)熒光qPCR反應(yīng)管數(shù)為n，n為待檢樣品數(shù)+

陽(yáng)性對(duì)照管數(shù)+陰性對(duì)照管數(shù)，每個(gè)反應(yīng)體系見(jiàn)表1，配制體系時(shí)建議按照n+1個(gè)反應(yīng)進(jìn)行配制，配制反

應(yīng)體系建議在冰盒中進(jìn)行；配制好的反應(yīng)液充分混勻后，按照每管18μL分裝于PCR反應(yīng)管內(nèi)，并做好

標(biāo)識(shí)。

表1每個(gè)反應(yīng)體系配制表

組分用量

2×TaqManFastqPCRMasterMix10μL

上游特異性PCR引物（10μmol/L）0.5μL

下游特異性PCR引物（10μmol/L）0.5μL

TaqMan探針（10μmol/L）0.5μL

滅菌雙蒸水6.5μL

總體積18μL

7.2.2加樣

3

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在核酸提取區(qū)進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)管中按順序分別加入2μL待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照DNA溶液，

蓋好蓋子后，PCR微量離心機(jī)瞬時(shí)離心30s，轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)。

7.2.3qPCR擴(kuò)增檢測(cè)

在PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。

7.2.3.1熒光通道

將PCR反應(yīng)管放入熒光PCR儀內(nèi)，設(shè)置探針：5’端選擇FAM熒光通道，3’端選擇無(wú)（none）熒光。

7.2.3.2熒光qPCR反應(yīng)條件

gD和gE基因熒光qPCR反應(yīng)條件均為：94℃3min；94℃15s，60℃45s，收集熒光，40

個(gè)循環(huán)。

8結(jié)果判定

8.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

8.2質(zhì)量控制

8.2.1陰性對(duì)照無(wú)Ct值，且無(wú)典型的S型擴(kuò)增曲線。

8.2.2陽(yáng)性對(duì)照FAM通道Ct值≤30，且擴(kuò)增曲線為典型的S型。

8.2.3以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。

8.3結(jié)果描述及判定

8.3.1gD基因檢測(cè)結(jié)果

8.3.1.1陰性

無(wú)Ct值或Ct值＞38，且無(wú)典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV核酸陰性。

8.3.1.2陽(yáng)性

Ct值≤36，且擴(kuò)增曲線為典型的S型，報(bào)告為PRV核酸陽(yáng)性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測(cè)來(lái)進(jìn)行PRV野

毒與疫苗毒的鑒別檢測(cè)。

8.3.1.3可疑

36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開(kāi)始進(jìn)行一次重復(fù)檢測(cè)。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為36＜Ct值

≤38，且擴(kuò)增曲線均呈典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV核酸陽(yáng)性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測(cè)來(lái)進(jìn)行PRV

野毒與疫苗毒的鑒別檢測(cè)。

8.3.2gE基因檢測(cè)結(jié)果

8.3.2.1陰性

無(wú)Ct值或Ct值＞38，且無(wú)典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV野毒核酸陰性。

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8.3.2.2陽(yáng)性

Ct值≤36，且擴(kuò)增曲線為典型的S型，報(bào)告為PRV野毒核酸陽(yáng)性。

8.3.2.3可疑

36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開(kāi)始進(jìn)行一次重復(fù)檢測(cè)。如重復(fù)檢測(cè)結(jié)果仍為36＜Ct值

≤38，且擴(kuò)增曲線均呈典型的S型擴(kuò)增曲線，報(bào)告為PRV野毒核酸陽(yáng)性。

8.3.3鑒別方法

針對(duì)缺失包含gE基因在內(nèi)的PRV活疫苗免疫豬只，如果gE基因檢測(cè)陽(yáng)性，則判定為PRV野毒核酸陽(yáng)性；

如果gD基因檢測(cè)陽(yáng)性而gE基因檢測(cè)陰性，則判定為PRV疫苗毒陽(yáng)性；如果gD基因和gE基因檢測(cè)均為陰性，

則判定為PRV核酸陰性，既無(wú)PRV野毒也無(wú)疫苗毒。針對(duì)未免疫缺失gE基因的PRV疫苗（△gE/PRV）的豬

只，如果gD基因或gE基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則判定為PRV野毒核酸陽(yáng)性；如果gD基因和gE基因檢測(cè)均為

陰性，則判定為PRV核酸陰性。

5

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

A.18mmol/LNaOH溶液的配制

稱量0.32gNaOH，溶解到1000mL滅菌去離子水中，混勻，分裝，常溫保存。

A.20.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

A.2.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g，先加適量去離子水溶

解，最后定容至1000mL，混勻。

A.2.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加適量去離子水溶

解，最后定容至1000mL，混勻。

A.2.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱取氯化鈉38g，用

無(wú)離子水溶解稀釋至5000mL，4℃保存。

6

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BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

引物和探針

名稱序列（5’-3’）

gD-qF（上游引物）GTTCAACGAGGGCCAGTACC

gD-qR（下游引物）CGGCGTCAGGAATCGCATCA

gD-P（探針）FAM-ACCAGCACCGCACGTACAAG-BHQ1

gE-qF（上游引物）CCGAGGACGAGTTCAGCA

gE-qR（下游引物）GGCCCATTCGTCACTTCCG

gE-P（探針）FAM-ACCAGACGTCGAAGCCGGA-BHQ1

注：引物和探針均由生物公司合成，用無(wú)菌無(wú)核酸酶水配制成10μmol/L工作液，-20℃以下普通冰箱中保存供檢

測(cè)用。

_________________________________

7

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目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3縮略語(yǔ)............................................................................1

4儀器和耗材........................................................................1

5試劑和材料........................................................................1

6樣品采集、處理和運(yùn)輸..............................................................2

7熒光qPCR操作程序.................................................................3

8結(jié)果判定..........................................................................4

附錄A（規(guī)范性附錄）溶液配制........................................................6

附錄B（規(guī)范性附錄）引物和探針......................................................7

I