兩代生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)方法

附件12兩代生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)方法Two-GenerationReproductiveToxicityStudy范圍本規(guī)范規(guī)定了兩代生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)基本原則，試驗(yàn)方法和技術(shù)要求。本規(guī)范用于檢測化妝品原料的生殖發(fā)育毒性。試驗(yàn)?zāi)康奶峁╆P(guān)于受試物產(chǎn)前、產(chǎn)后暴露對雌性、雄性動(dòng)物生殖功能、生育力及子代發(fā)育影響的確切信息。定義生殖毒性Reproductiontoxicity對后代產(chǎn)生有害作用，并損傷雄性和雌性的生殖功能和生殖能力。發(fā)育毒性Developmentaltoxicity生殖毒性的表現(xiàn)，具體表現(xiàn)為后代在產(chǎn)前、圍產(chǎn)期、產(chǎn)后發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能紊亂。母體毒性Maternaltoxicity受試物引起親代雌性妊娠動(dòng)物直接或間接的健康損害效應(yīng)，表現(xiàn)為增重減少、功能異常、毒性反應(yīng)、甚至死亡。未觀察到有害作用劑量NOAEL通過動(dòng)物試驗(yàn)，以現(xiàn)有的技術(shù)手段和檢測指標(biāo)未觀察到任何與受試物相關(guān)的毒性作用的最大劑量。觀察到有害作用的最低劑量LOAEL在規(guī)定的條件下，受試物引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織形態(tài)、功能、生長發(fā)育等有害效應(yīng)的最小作用劑量。試驗(yàn)的基本原則通過對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以受試物暴露，考察其對雄性和雌性動(dòng)物生殖功能、生育力及生殖系統(tǒng)形態(tài)的影響。若該暴露（直接或間接）持續(xù)至子代，則還可以繼續(xù)考察受試物對子代發(fā)育，甚至子代生殖功能和生育力的影響。受試物配制化妝品生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)一般采用經(jīng)口途徑給予受試物，但基于人的可能暴露途徑或受試物的特性而選擇經(jīng)皮或吸入也是合適的。溶媒對照應(yīng)采用與之相同的給予途徑。若設(shè)置陽性對照，其處理方式可以不同于受試物處理組。一般情況下首選水作為溶媒，可以是水溶液也可以是混懸液，其次可以選擇玉米油作為溶媒配制成乳濁液，也可以將其與水混合配制成油溶液。使用水以外的其它溶媒，應(yīng)闡明其毒性并保證所配制溶液的穩(wěn)定性。其它應(yīng)納入考慮的因素包括：溶媒是否影響受試物化學(xué)特征繼而改變受試物毒性；溶媒是否影響受試物的吸收、代謝、分布和蓄積；溶媒是否影響動(dòng)物食物和飲水?dāng)z入繼而影響營養(yǎng)狀況；溶媒本身是否有潛在毒性。經(jīng)口灌胃時(shí)，以大鼠為例，水溶性液體的灌胃體積一般不超過10mL/kg體重，最大不超過20mL/kg體重；油溶性液體的灌胃體積不超過4mL/kg體重。經(jīng)飼料或飲水給予時(shí)，應(yīng)充分考慮溶媒添加量和動(dòng)物熱量的攝入。若使用溶媒，那么對照組應(yīng)按受試物組的最高使用量添加；若不使用溶媒，且受試物會造成攝食量或食物利用率的降低，那么可以通過將其飼喂未交配動(dòng)物作為配對對照組，但是，如有資料表明食物消耗的降低并不影響生殖相關(guān)參數(shù)，可以不設(shè)置配對對照。若無特殊理由建議通過口服給藥。經(jīng)皮給予受試物時(shí)，應(yīng)考慮受試物濃度對皮膚的刺激性。若在既定劑量下的濃度產(chǎn)生較為嚴(yán)重的皮膚刺激性，應(yīng)將濃度適當(dāng)降低。當(dāng)然，這種降低可能也伴隨劑量的降低。如果因濃度過高，在早期就出現(xiàn)皮膚嚴(yán)重受損的情況下，應(yīng)終止試驗(yàn)并選擇合適的濃度重新開始。受試物皮膚暴露面積應(yīng)達(dá)到動(dòng)物全身皮膚的10%，毒性過高的受試物也可以小于10%?？梢圆捎眉啿己蜔o刺激性膠帶將受試物固定在皮膚表面，需要保證每天6小時(shí)的接觸時(shí)長，同時(shí)也可以采用非保定方式（如防抓咬保護(hù)脖套）防止動(dòng)物攝入受試物或弄掉封閉膠帶。經(jīng)吸入給予受試物時(shí)，一般采用氣體、蒸汽、氣溶膠或以上混合形態(tài)進(jìn)行受試物暴露。吸入受試物所采用的暴露物態(tài)應(yīng)根據(jù)其理化性質(zhì)、擬定濃度和/或其實(shí)際應(yīng)用時(shí)的物態(tài)加以確定。不論采用頭鼻暴露還是全身暴露，染毒柜內(nèi)氧氣濃度含量不低于19%，二氧化碳含量低于1%，同時(shí)確保受試物濃度穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇首選種屬為大鼠，若選擇其它種屬動(dòng)物應(yīng)有合理理由，同時(shí)應(yīng)避免選擇生育力低且具有明顯發(fā)育缺陷的動(dòng)物種屬。所選動(dòng)物應(yīng)健康且未經(jīng)歷任何試驗(yàn)，其中雌性動(dòng)物應(yīng)為未經(jīng)產(chǎn)或未孕動(dòng)物。試驗(yàn)開始時(shí)動(dòng)物體重的差異應(yīng)不超過平均體重的±20%，若有必要還應(yīng)基于發(fā)情周期篩選動(dòng)物，將發(fā)情周期正常的雌性納入試驗(yàn)。動(dòng)物數(shù)量應(yīng)保證每組至少有20只懷孕雌性動(dòng)物，在極端情況下，未能產(chǎn)生足夠的懷孕動(dòng)物時(shí)，不表明研究數(shù)據(jù)無效，需個(gè)案分析。雄性動(dòng)物數(shù)量推薦與雌性動(dòng)物保持一致。動(dòng)物的準(zhǔn)備和飼養(yǎng)動(dòng)物抵達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)施后，應(yīng)有不少于5天的環(huán)境適應(yīng)期。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，飲水不限制。但應(yīng)注意飲食和墊料中植物雌激素的含量，避免影響某些生殖終點(diǎn)。所用批次飼料留樣并適當(dāng)保存至報(bào)告完成，以便在某些情況下進(jìn)行回溯分析。動(dòng)物交配前可以多只動(dòng)物飼養(yǎng)于一籠，雌性動(dòng)物交配成功后（檢查到陰栓或陰道涂片陽性）應(yīng)單籠飼養(yǎng)于含墊料的籠具內(nèi)，其所產(chǎn)F1代同籠飼養(yǎng)至離乳。離乳后的F1代應(yīng)按組別、性別分籠飼養(yǎng)，如有合理理由亦可單籠飼養(yǎng)。暴露途徑的選擇推薦采用經(jīng)口方式（包括飼料、飲水和灌胃），除非其它暴露途徑（經(jīng)皮或吸入）更為合適。劑量和分組常規(guī)劑量設(shè)計(jì)通常情況下，設(shè)置3個(gè)劑量組和1個(gè)溶媒對照組。劑量水平的選擇應(yīng)參考已有毒理資料，如非妊娠動(dòng)物的TK數(shù)據(jù)，受試物的血乳屏障透過率，人體暴露估計(jì)等。在有TK數(shù)據(jù)的情況下，相關(guān)資料表明受試物具有劑量依賴飽和特征，且人體暴露量遠(yuǎn)低于飽和劑量，設(shè)置受試物高劑量時(shí)選擇動(dòng)力學(xué)曲線向非線性轉(zhuǎn)變的拐點(diǎn)比較適合，可避免出現(xiàn)飽和。在缺乏TK數(shù)據(jù)支持的情況下，劑量水平的選擇應(yīng)基于受試物的毒性，如高劑量應(yīng)產(chǎn)生一定程度的全身毒性，但不致死或造成動(dòng)物嚴(yán)重的痛苦。在高劑量以下按等比關(guān)系設(shè)置中低劑量，低劑量應(yīng)能夠確定NOAEL或可以用于推導(dǎo)基準(zhǔn)劑量（Benchmarkdose,BMD）。通常2-4倍的劑量間距較為合適，不宜采用過大的間距，如擬設(shè)間距超過10，則應(yīng)采用增加劑量組的方法以降低間距。若通過飼料給予受試物，則劑量間距不應(yīng)超過3倍。若有溶媒對照，溶媒對照應(yīng)采用受試物處理組用到的最大體積作為本組動(dòng)物的給予體積。限制劑量試驗(yàn)人的可能暴露水平低于1000mg/kg，是開展限制劑量試驗(yàn)的前提條件。在重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)中高于1000mg/kg的情況下無毒性表征，或者無結(jié)構(gòu)或代謝類似物的相關(guān)資料，那么僅設(shè)計(jì)1000mg/kg的單劑量水平已足夠。若在此劑量水平觀察到生殖發(fā)育毒性，則需要在更低劑量水平確定NOAEL。試驗(yàn)內(nèi)容試驗(yàn)步驟F0大鼠從5到9周齡開始連續(xù)給予受試物。雌性通常持續(xù)暴露至F1代離乳，雄性在不需進(jìn)行其它生殖效應(yīng)評價(jià)后可以人道處死，但是，所有F0代動(dòng)物均應(yīng)保證交配前共計(jì)10周，交配期共計(jì)2周的受試物暴露期。（流程見附圖）F1離乳時(shí)，從每窩選擇一雌一雄用于交配，自離乳開始每日給予受試物，若暴露途徑為飲水或食物，則其實(shí)際暴露可能始于哺乳期。交配期前連續(xù)暴露至少10周，并在交配期仍持續(xù)暴露2周，一直持續(xù)至F2代離乳（流程見附圖）。不用于交配的F1和所有F2均于離乳時(shí)人道處死，并從每窩分別選取一雌一雄用于大體解剖觀察。交配同劑量組的雌雄大鼠按1:1進(jìn)行交配，交配最多持續(xù)2周。通過在早晨檢查陰栓或陰道涂片來確定交配成功與否，一旦確定交配成功的雌性應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng)，并把發(fā)現(xiàn)交配成功的當(dāng)天定為妊娠第0天（G0）。如若交配不成功，應(yīng)選擇同組已成功交配的其它雄性繼續(xù)交配，配對信息應(yīng)準(zhǔn)確記錄。在離乳動(dòng)物中，從每窩選取至少一雌一雄在性成熟后進(jìn)行交配且交配應(yīng)在同組不同窩間開展。F1的選取應(yīng)遵循隨機(jī)原則，但體重不應(yīng)低于每窩平均體重兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。通常情況下不推薦進(jìn)行二次交配，因?yàn)槎谓慌鋵⒉坏貌皇ブ残畔ⅰ５?，如出現(xiàn)受試物相關(guān)的窩產(chǎn)仔數(shù)變化或第一次交配中觀察到可疑的結(jié)果，仍建議F0或F1再次交配。同時(shí)，也建議將未成功懷孕的雌性動(dòng)物與能正常生育的雄性進(jìn)行二次交配，以確證雌性生育力。二次交配的時(shí)間應(yīng)選在最后一胎離乳后大約一周左右。窩的標(biāo)準(zhǔn)化在出生后第4天，通過隨機(jī)選擇調(diào)整窩的大小，盡可能達(dá)到每窩每性別5只，若難以達(dá)到，做部分調(diào)整也可接受（例如：4只雌性和6只雄性）。窩的標(biāo)準(zhǔn)化不宜以體重及肛殖距（AGD）為依據(jù)。臨床觀察每天應(yīng)進(jìn)行一般臨床觀察，在灌胃給藥的情況下，其觀察時(shí)間點(diǎn)應(yīng)考慮到給藥后預(yù)期的毒性效應(yīng)高峰時(shí)期。觀察并記錄行為改變、難產(chǎn)或長時(shí)間分娩以及所有毒性癥狀。更詳細(xì)的臨床觀察至少每周一次，可以在給動(dòng)物稱重時(shí)進(jìn)行。每天兩次籠旁觀察，觀察內(nèi)容包括嚴(yán)重的毒性反應(yīng)、發(fā)病率和死亡率。每天應(yīng)進(jìn)行一般臨床觀察，在灌胃給藥的情況下，其觀察時(shí)間點(diǎn)應(yīng)考慮到給藥后預(yù)期的效果高峰時(shí)期，觀察F1和F2是否有行為改變，是否有外觀異常，是否出現(xiàn)毒性癥狀。此外，F(xiàn)1還應(yīng)觀察是否難產(chǎn)或長時(shí)間分娩。更詳細(xì)的臨床觀察至少每周一次，可以在給動(dòng)物稱重時(shí)進(jìn)行。每天兩次籠旁觀察，觀察內(nèi)容包括嚴(yán)重的毒性反應(yīng)、發(fā)病率和死亡率。在分娩后（LD0）應(yīng)盡快檢查每窩幼仔，以確定幼仔的數(shù)量和性別、存活與否以及是否存在明顯外觀異常。在第0天發(fā)現(xiàn)死亡的幼仔，如果不是浸軟胎，建議檢查可能存在缺陷和/或死亡原因，并將其保存。子代其它額外的發(fā)育信息，如睜眼，耳廓分離，萌牙，出毛的發(fā)生時(shí)間可以結(jié)合性成熟數(shù)據(jù)分析，如陰道口張開及包皮龜頭分離時(shí)的日齡和體重。如果沒有單獨(dú)的功能觀察組合試驗(yàn)，那么在F1（非交配用）離乳前后可以觀察運(yùn)動(dòng)能力，感覺功能，個(gè)體反射（出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常時(shí)可以不開展功能觀察組合試驗(yàn)）。若F1的性別比或性成熟時(shí)間出現(xiàn)受試物相關(guān)改變后，則需在PND0測量F2的肛殖距。體重、攝食及飲水親代動(dòng)物（F0和F1）受試物處理第一天應(yīng)稱體重，此后至少每周稱一次。其中，雌性應(yīng)在妊娠第0天、第7天、第14天和第20天（或第21天），以及解剖當(dāng)天稱重，哺乳期與幼仔同一天稱量，但哺乳期第4天可以不稱重。子代在哺乳期第0天、第4天、第7天、第14天和第21天及解剖當(dāng)天稱重。交配前和妊娠期間，每周至少測量一次食物消耗量。如果受試物經(jīng)飲水給予，則至少每周測量一次飲水。動(dòng)情周期交配前和交配期間通過陰道涂片進(jìn)行雌性動(dòng)情周期的評估，直到確認(rèn)交配成功。在制作陰道涂片時(shí)，應(yīng)注意避免過度刺激粘膜從而誘導(dǎo)假孕。精子參數(shù)解剖時(shí)，稱重睪丸和附睪，至少保留一側(cè)用于組織病理學(xué)檢查。每組至少10只雄性的睪丸和附睪分別用于超聲勻漿耐受精子細(xì)胞頭部計(jì)數(shù)和附睪尾精子計(jì)數(shù)。用于精子計(jì)數(shù)的附睪，還可以用于評估精子活力和精子形態(tài)，也可另外從輸精管采集精子用于以上分析。其中，用于精子形態(tài)分析的樣本可以是濕樣本，也可以是固定樣本。精子形態(tài)分析應(yīng)至少觀察200個(gè)精子，異常精子形態(tài)包括頭部融合、斷頭、頭部異形、尾部異形。若擬分析精子樣本來自于解剖時(shí)及時(shí)凍存的樣本或固定后的涂片，抑或直接采用精子分析儀等計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)及時(shí)采集樣本圖像分析，那么精子參數(shù)的分析可稍后進(jìn)行，否則應(yīng)在動(dòng)物尸體剖驗(yàn)時(shí)立刻進(jìn)行分析。先分析高劑量組和對照組，在有受試物相關(guān)性時(shí)需擴(kuò)展至更低的劑量組。如果上述精子評估參數(shù)中的任何一項(xiàng)已經(jīng)在90天或更久的系統(tǒng)毒性研究中進(jìn)行了檢查，則相應(yīng)的精子參數(shù)不必在兩代生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)中重復(fù)。解剖與病理F0在解剖當(dāng)日早上完成體重測量后，制作雌鼠陰道涂片以確定動(dòng)情周期，便于結(jié)合卵巢的組織病理結(jié)果分析。解剖時(shí)大體觀察所有組織臟器，尤其應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注生殖系統(tǒng)，并記錄所有大體觀察異常情況和子宮著床痕數(shù)量。以下臟器在完成肉眼觀察后應(yīng)稱重，成對的臟器需單獨(dú)稱重。子宮、卵巢；睪丸、附睪（整體和尾部）；前列腺；精囊腺、凝固腺及其分泌物（整體稱重）；腦、肝、腎、脾、垂體、甲狀腺和腎上腺及已知靶器官。所保存的臟器中，需要開展組織病理檢查的臟器包括：陰道、子宮（含宮頸）、卵巢；睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、凝固腺；已明確的靶器官；通常先在對照組和高劑量組開展組織病理檢查，若發(fā)現(xiàn)受試物相關(guān)改變可繼續(xù)檢查其它劑量組。此外，疑似生育力降低的情況（未交配成功、未孕、未正常分娩、產(chǎn)生非健康后代、動(dòng)情周期異常、精子參數(shù)改變等）需要對生殖系統(tǒng)進(jìn)行組織病理檢查，大體解剖肉眼觀察異常的組織臟器也應(yīng)進(jìn)行組織病理檢查。睪丸的組織病理檢查建議關(guān)注是否有精子潴留，上皮形態(tài)及細(xì)胞層數(shù)是否改變，是否有多核巨細(xì)胞的形成，管腔內(nèi)是否有脫落上皮。附睪的檢查應(yīng)包含完整的頭、體、尾縱切面。建議關(guān)注是否有白細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)是否有異常形態(tài)的精子細(xì)胞，是否發(fā)生巨噬細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象。卵巢的組織病理檢查則主要采用定量的方法以檢測原始卵泡是否減少，也可以結(jié)合初級卵泡進(jìn)行比較。定量分析時(shí)，應(yīng)保證每組至少10只動(dòng)物，同時(shí)還要考慮連續(xù)切片抽取間距及切片厚度等因素。需要解剖并大體觀察的子代包括：F2離乳時(shí)從每窩隨機(jī)挑選的一雌一雄及其親代F1；F1離乳時(shí)從每窩隨機(jī)挑選的非交配用一雌一雄；所有臨床觀察異常或外觀異常的子代；瀕死狀態(tài)人道處死的幼仔；死產(chǎn)幼仔（非浸軟胎）。其中，在瀕死狀態(tài)人道處死的幼仔和死亡幼仔，應(yīng)檢查可能的缺陷和/或死亡原因，并保存。初產(chǎn)雌性子宮應(yīng)在計(jì)數(shù)著床痕后固定保存。需要稱重的組織臟器包括：交配用F1子宮、卵巢；交配用F1睪丸、附睪（整體和尾部）；交配用F1前列腺；交配用F1精囊腺、凝固腺及其分泌物（整體稱重）；交配用F1腦、肝、腎、脾、垂體、甲狀腺和腎上腺及已知靶器官。此外，離乳時(shí)從F1和F2隨機(jī)選取用于大體解剖觀察的一雌一雄僅需稱重腦、胸腺和脾臟。需要做組織病理的子代動(dòng)物有：大體解剖觀察到異常的動(dòng)物；臨床觀察出現(xiàn)毒性反應(yīng)的動(dòng)物；離乳時(shí)每窩隨機(jī)選取的一雌一雄F1和F2外觀異常的動(dòng)物；交配用F1；需要做組織病理檢查的組織臟器包括：陰道、子宮（含宮頸）、卵巢；睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、凝固腺；大體解剖觀察到異常的組織臟器；已明確的靶器官。通常先在對照組和高劑量組開展組織病理檢查，若發(fā)現(xiàn)受試物相關(guān)改變可繼續(xù)檢查其它劑量組。此外，疑似生育力降低的情況（未交配成功、未孕、未正常分娩、產(chǎn)生非健康后代、動(dòng)情周期異常、精子參數(shù)改變等）需要對生殖系統(tǒng)進(jìn)行組織病理檢查，大體解剖肉眼觀察異常的組織臟器也應(yīng)進(jìn)行組織病理檢查。睪丸的組織病理檢查建議關(guān)注是否有精子潴留，上皮形態(tài)及細(xì)胞層數(shù)是否改變，是否有多核巨細(xì)胞的形成，管腔內(nèi)是否有脫落上皮。附睪的檢查應(yīng)包含完整的頭、體、尾縱切面。建議關(guān)注是否有白細(xì)胞浸潤，管腔內(nèi)是否有異常形態(tài)的精子細(xì)胞，是否發(fā)生巨噬細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象。卵巢的組織病理檢查主要關(guān)注原始卵泡是否減少，并計(jì)數(shù)原始卵泡數(shù)量，計(jì)數(shù)必須緊密結(jié)合切面的數(shù)量、切面間距及受檢動(dòng)物總數(shù)。數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)方法及結(jié)果評定10.1應(yīng)獲得的試驗(yàn)結(jié)果食物消耗，飲水消耗（如有），食物利用率（每克食物增重，合籠和哺乳期后期至少三分之一除外），通過飼料和飲水給予受試物的還需要計(jì)算受試物的攝入；吸收數(shù)據(jù)（如有）；用于交配的F0和F1動(dòng)物的體重?cái)?shù)據(jù)；窩體重和幼仔個(gè)體體重?cái)?shù)據(jù)；安樂死解剖時(shí)F0的體重、臟器絕對和相對重量數(shù)據(jù)；臨床癥狀的性質(zhì)、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間（是否可逆）；試驗(yàn)期間動(dòng)物死亡時(shí)間或動(dòng)物是否存活至試驗(yàn)結(jié)束；按性別和劑量組別分析毒性反應(yīng)數(shù)據(jù)，包括交配、生育、妊娠、出生，存活、哺乳，且報(bào)告中體現(xiàn)用于分析的樣本量；在生殖、子代及出生后生長發(fā)育等方面有毒性效應(yīng)或其他效應(yīng)；大體解剖觀察結(jié)果；詳細(xì)描述所有組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)；F0和F1雌性具有正常動(dòng)情周期的動(dòng)物數(shù)量及動(dòng)情周期長度；F0和F1附睪尾精子總數(shù)，前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子百分比，形態(tài)正常和異常精子百分比；交配時(shí)間（即從開始合籠配對到交配完成的天數(shù)）妊娠天數(shù)；著床數(shù)、黃體數(shù)、窩的大?。换町a(chǎn)數(shù)和著床后丟失數(shù)；有明顯大體觀察異常的幼仔數(shù)量，經(jīng)確認(rèn)為矮小幼仔的動(dòng)物數(shù)量；幼仔發(fā)育里程碑的相關(guān)數(shù)據(jù)及其它產(chǎn)后發(fā)育數(shù)據(jù)，用于評估的發(fā)育里程碑事件應(yīng)合理；幼仔和成年動(dòng)物的功能觀察數(shù)據(jù)（如適用）；對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合適的統(tǒng)計(jì)分析。10.2數(shù)