PCR檢測中假病毒內(nèi)標和外標的制備(新)

PCR檢測中假病毒內(nèi)標和外標的制備黃秋英廈門大學(xué)分子診斷實驗室PCR檢測中假病毒內(nèi)標和外標的制備黃秋英廈門大學(xué)分子診斷1外標和內(nèi)標簡介外標和內(nèi)標簡介2

用來監(jiān)控試劑盒本身是否失效以及操作是否正常，用以排除因試劑盒失效或誤操作導(dǎo)致的“假陰性”。外標通常是含有待測基因片段的一定濃度的核酸序列，經(jīng)一系列的稀釋后與待測標本一起進行擴增，制作PCR擴增產(chǎn)物和靶核酸含量的標準曲線,根據(jù)待測標本的擴增產(chǎn)物量即可推算出靶核酸的絕對含量。在應(yīng)用于實時熒光PCR時，由于Ct值的重現(xiàn)性好以及Ct值與起始模板之間存在線性關(guān)系，實時熒光PCR可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。陽性質(zhì)控品(外標)陰性質(zhì)控品用來排除試劑或環(huán)境污染導(dǎo)致的“假陽性”

。

基因診斷試劑盒中的質(zhì)控品是評價檢測結(jié)果是否可靠的必需依據(jù)。質(zhì)控品包括：陽性質(zhì)控品(外標）、陰性質(zhì)控品以及最近開始采用的抑制質(zhì)控品（內(nèi)標）。用來監(jiān)控試劑盒本身是否失效以及操作是否正常，用以排除因3競爭性內(nèi)標

一段與被檢測目的基因具有相同的引物序列而不同的探針檢測區(qū)的片段，二者一起競爭引物，因而能夠真實的檢測到待測基因中是否存在抑制。由于采用相同的引物，內(nèi)標在擴增過程中必然與待測基因相互競爭，含量低的一方勢必受到抑制，通常當雙方濃度相差100倍以上時，濃度低的一方就無法擴增。非競爭性內(nèi)標

指內(nèi)標與待測基因具有不同的擴增引物，因而非競爭性內(nèi)標與待測目的基因之間不存在引物競爭關(guān)系。但在引物設(shè)計時必須考慮到多種PCR中的引物之間的相互影響，并且要選擇一個合適的內(nèi)標的使用濃度，以防止相互之間的抑制，影響檢測試劑盒的靈敏度。抑制質(zhì)控品(內(nèi)標)

直接加到待測標本中，同時提取和檢測，以確保檢測該標本時是否出現(xiàn)抑制或假陰性。內(nèi)標分為競爭性內(nèi)標和非競爭性內(nèi)標。競爭性內(nèi)標一段與被檢測目的基因具有相同的引物序列而不同4假病毒外標和內(nèi)標的優(yōu)點真實性純的核酸，像PCR產(chǎn)物、克隆的質(zhì)粒、人工合成的核酸片段，和要提取的標本核酸存在著很大的差別，不能夠真正體現(xiàn)質(zhì)控品的意義。以病毒為例，病毒是一個核酸與蛋白的復(fù)合體，病毒核酸的提取都有一個裂解的過程，而純的核酸是不存在這一過程的，所以就無法真正體現(xiàn)病毒核酸的提取過程。病毒最理想的就是質(zhì)控品它本身，但由于它的致病性，我們不可能用病毒作為質(zhì)控品，所以我們就模擬天然病毒的形態(tài)，通過基因工程的手段構(gòu)建出的含有目的核酸片段與包裝蛋白形成的復(fù)合體（即假病毒）來真實的體現(xiàn)病毒核酸的提取過程。

穩(wěn)定性假病毒是核酸片段與包裝蛋白形成的復(fù)合體，所以假病毒內(nèi)標、外標能耐受核酸酶，在血清等物質(zhì)中可以長期、穩(wěn)定的存在，且易于保存。假病毒外標和內(nèi)標的優(yōu)點真實性純的核酸，像PCR產(chǎn)物5

DNA假病毒

外標、內(nèi)標的制備DNA假病毒

外標、內(nèi)標的制備6一、實驗設(shè)計、實驗設(shè)計：

利用M13mp18噬菌體克隆技術(shù)，提出DNA假病毒質(zhì)控品這一新的質(zhì)控品制備技術(shù)，并以乙型肝炎病毒（HBV）的檢測為模型，說明這一技術(shù)制備的質(zhì)控品。二、實驗內(nèi)容

1）制備HBVDNA假病毒外標2）制備RBCS（1,5－二磷酸核酮糖羥化酶基因)DNA假病毒內(nèi)標3）DNA假病毒的質(zhì)量評估

一、實驗設(shè)計7M13噬菌體簡介M13噬菌體是絲狀噬菌體，其基因大小為6407bp，是單鏈閉環(huán)DNA分子。M13mp18是改造過的M13噬菌體克隆載體，其上面帶有一個通用的多克隆位點（MCS），可以方便的將外源DNA片段克隆進去。并且因其插入了LacZ基因，可以用藍白噬菌斑篩選方法，得到含有目的片段的陽性克隆。利用M13噬菌體表達與純化方法，就可以得到大量的含有外源DNA片段的噬菌體。

M13噬菌體簡介M13噬菌體是絲狀噬菌體，其基因大小為6408HBVDNA假病毒外標和RBCSDNA假病毒內(nèi)標的制備HBVDNA假病毒外標和RBCSDNA假病毒內(nèi)標的制備9DNA假病毒的掃描電鏡觀察（1X50000）HBVDNA假病毒RBCSDNA假病毒大量培養(yǎng)并純化的噬菌體假病毒，經(jīng)負染后，用50,000X的掃描電鏡觀察，其形態(tài)為典型的M13噬菌體結(jié)構(gòu)，成絲狀，外圍是包裝蛋白，中間是單鏈DNA,長約180nm,寬約20nm。DNA假病毒的掃描電鏡觀察（1X50000）HBVDNA假10HBVDNA假病毒陽性克隆的實時熒光PCR驗證HBVDNA假病毒陽性克隆的實時熒光PCR驗證11RBCSDNA假病毒陽性克隆實時熒光PCR驗證RBCSDNA假病毒陽性克隆實時熒光PCR驗證1212345678910

ABCLane1:blankLane2:L3Lane3:L3+DNaseILane4:L4Lane5:L4+DNaseILane6:pUC19/MspImarkerLane7:L5Lane8:L5+DNaseILane9:L6Lane10:L6+DNaseIAHBVDNA假病毒；B質(zhì)粒；C單鏈DNADNA假病毒、質(zhì)粒及單鏈DNA耐受DNA酶實驗比較123413AB（第1天）（37℃,第30天）DNA假病毒在血清中的穩(wěn)定性取大量制備的HBVDNA假病毒，用陰性血清按1/10梯度稀釋成L1-L7共7個梯度。稀釋好的HBVDNA假病毒放入37℃溫箱中孵育不同時間后，用實時PCR檢測其濃度的變化。取樣時間分別為5天、10天、15天、30天。

AB（第1天）（37℃,第30天）DNA假病毒在血清中的14內(nèi)標對外標定量工作曲線的影響將HBVDNA假病毒外標作梯度稀釋，考察RBCS內(nèi)標對HBV外標工作曲線的影響紅色箭頭：未加RBCS假病毒內(nèi)標黑色箭頭：加RBCS假病毒內(nèi)標內(nèi)標對外標定量工作曲線的影響將HBVDNA假病毒外標15外標對內(nèi)標的影響理想的內(nèi)標是不論外標濃度的高低，內(nèi)標本身都能夠擴增。將HBV假病毒外標作梯度稀釋，加入大約1000copies/mL的RBCS假病毒內(nèi)標后，用實時熒光PCR考察不同濃度的HBV假病毒外標對RBCS假病毒內(nèi)標的影響。外標對內(nèi)標的影響理想的內(nèi)標是不論外標濃度的高低，內(nèi)標16小結(jié)用M13mp18載體構(gòu)建的DNA假病毒，具有以下幾個優(yōu)點：1、構(gòu)建方法簡單2、穩(wěn)定性好：能夠耐受核酸酶的降解，且能在血清長期保存3、真實性：能夠真正體現(xiàn)病毒的提取過程4、生物安全性小結(jié)用M13mp18載體構(gòu)建的DNA假病毒，具有以下幾個優(yōu)點17

RNA假病毒

外標、內(nèi)標的制備RNA假病毒

外標、內(nèi)標的制備18一、實驗設(shè)計

利用RNA假病毒技術(shù)，制備可用于SARS病毒RT-PCR檢測的外標及可用于RNA病毒檢測分析的內(nèi)標。二、實驗內(nèi)容

制備SARSRNA假病毒外標制備RBCSRNA假病毒內(nèi)標RNA假病毒的質(zhì)量評估一、實驗設(shè)計19

MS2噬菌體簡介

MS2噬菌體2噬菌體簡介

MS2噬菌體是正義單鏈RNA病毒,基因組全長為3569bp，編碼4個蛋白質(zhì)。

每個MS2噬菌體是含有180個拷貝的衣殼蛋白,一拷貝的成熟蛋白，包裹一分子RNA的正二十面體。d≈27nm

MS2噬菌體簡介MS2噬菌體2噬菌體簡介MS2噬20RNA假病毒的形成過程

RNA假病毒的形成過程

21SARSRNA假病毒外標和RBCSRNA假病毒內(nèi)標的制備SARSRNA假病毒外標和RBCSRNA假病毒內(nèi)標的制備22RNA假病毒的透射電鏡觀察(1X100000)ASARSRNA假病毒BRBCSRNA假病毒

RNA假病毒的透射電鏡觀察(1X100000)A23SARSRNA假病毒陽性克隆的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR驗證SARSRNA假病毒陽性克隆的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR驗證24RBCSRNA假病毒陽性克隆的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR驗證RBCSRNA假病毒陽性克隆的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR驗證25RNA假病毒耐受DNA酶、RNA酶實驗

RNA假病毒耐受DNA酶、RNA酶實驗26用混合血清溶解，第0天實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR的效果用混合血清溶解，37oC第7天實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR的效果SARSRNA假病毒在血清中的穩(wěn)定性用混合血清溶解，第0天實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR的效果用混合血清溶27內(nèi)標對外標定量工作曲線的影響黑色：未加RBCS假病毒內(nèi)標灰色：加RBCS假病毒內(nèi)標內(nèi)標對外標定量工作曲線的影響黑色：未加RBCS假病毒內(nèi)標28外標對內(nèi)標的影響外標對內(nèi)標的影響29

RNA假病毒技術(shù)采用基因工程表達的蛋白－RNA復(fù)合體，具有蛋白外殼包裹RNA的結(jié)構(gòu)特點，對RNA提供了有效地保護，使包裹的RNA能耐受核酸酶的降解,從而徹底解決了RNA不穩(wěn)定問題。這一