新型冠狀病毒基因溯源技術規(guī)范

DB36/XXXXX—XXXX新型冠狀病毒基因溯源技術規(guī)范范圍本文件規(guī)定了新型冠狀病毒基因溯源樣本的采集、運輸與保存、全基因組測序、序列生成與比對和結果解讀與反饋。本文件適用于衛(wèi)生系統(tǒng)承擔新型冠狀病毒測序樣本采集、運輸、保存以及基因測序工作的實驗室。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。(注：此章節(jié)需要列出正文部分引用的文件)GB19489實驗室生物安全通用要求HJ91.1污水監(jiān)測技術規(guī)范WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則WS/T640臨床微生物學檢驗樣本的采集和轉運WS/T776農貿(集貿)市場新型冠狀病毒環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范WS/T697新冠肺炎疫情期間特定人群個人防護指南《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》國家衛(wèi)生健康委(國衛(wèi)辦科教函〔2020〕70號)《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》原衛(wèi)生部(第45號令)《新型冠狀病毒肺炎防控方案》《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號)《江西省病原微生物實驗室生物安全管理辦法》(贛衛(wèi)科教發(fā)〔2018〕3號)《轉發(fā)國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于做好新型冠狀病毒實驗室檢測生物樣本管理工作的通知》（贛衛(wèi)科教函〔2020〕1號）術語和定義下列術語和定義適用于本文件。新型冠狀病毒SARS-CoV-2Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2引起新型冠狀病毒肺炎的病原體,為冠狀病毒屬的一個種。注:國際病毒分類委員會2020年2月11日將新型冠狀病毒命名為“嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2”。全基因組測序Wholegenomesequencing對生物樣本整個基因組序列進行測定，獲得完整的基因組信息?；蛩菰礃颖静杉蛩菰礃颖具x取原則病例數較多時，應結合流行病學信息和病例傳播鏈關系，優(yōu)先選擇以下樣本開展測序：每起聚集性疫情的首代病例；感染來源不明的病例；早期感染者、與早期感染者有流行病學關朕的關鍵病例；有境外人員、中高風險地區(qū)人員、入境物品或冷鏈食品等接觸史的病例；早期感染者接觸的冷鏈食品、非冷鏈境外快遞物流物品及其運輸工具，以及關聯的輸入病例呼吸道、排泄物、污水等可能為疫情源頭的病毒核酸陽性樣本。應選擇核酸檢測結果Ct值小于32的樣本進行測序（關鍵樣本除外）。樣本類型病例必須采集急性期呼吸道樣本（包括上呼吸道樣本或下呼吸道樣本），重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道樣本，根據臨床需要可留取大便樣本。溯源過程的物品和環(huán)境需采集表面拭子樣本，還可采集環(huán)境污水樣本。采集方法人源樣本：按照最新版《新型冠狀病毒肺炎防控方案》的相關要求進行人員樣本采集。食品及其包裝表面拭子樣本：按照WS/T776的相關要求進行食品及其包裝表面拭子樣本采集。物體表面拭子樣本：按照WS/T776的第6項樣本采集的相關要求進行物體表面拭子樣本采集。污水樣本：污水采樣應符合HJ91.1的規(guī)定，按照WS/T776的第6項樣本采集的相關要求進行污水樣本采集。采集要求早期感染者、特殊職業(yè)、感染來源不明等關鍵病例可采集2份鼻咽拭子放置在1個釆樣管內，以提高病毒載量用于病毒基因組測序。對早期感染者及其密切接觸者排查發(fā)現的可疑物品、可疑場所在消毒前進行采樣。采用非滅活型病毒采樣管進行采樣，確保采樣管包裝完好，在保質期內使用。溯源過程的物品和環(huán)境采樣可釆取以下“兩階段、全覆蓋、混釆”的原則：①第一階段釆樣：經流行病學調查針對病毒溯源初步指向的某物品或冷鏈食品進行采樣時，應對該物品或冷鏈食品及同批次所有物品或冷鏈食品采取大范圍涂抹方式進行全覆蓋采樣或高密度抽檢。②第二階段釆樣：在第一階段采樣基礎上，如果檢出陽性樣本，應以進行病毒全基因組測序和病毒分離培養(yǎng)為目標。樣本運輸與保存運輸要求樣本按WS/T640、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》相關要求進行轉運，由專人、專車4小時內送達實驗室。樣本轉運箱封閉前，須使用75%酒精或0.2%含氯消毒劑消毒容器表面。樣本保存用于病原檢測的標本應當盡快進行檢測，24小時內檢測的標本可置于4℃保存；24小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存(如無-70℃保存條件,則于-20℃冰箱暫存)。根據《轉發(fā)國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于做好新型冠狀病毒實驗室檢測生物樣本管理工作的通知》（贛衛(wèi)科教函〔2020〕1號）相應要求所有新型冠狀病毒實驗室檢測生物樣本送至江西省疾病預防控制中心保存。全基因組測序實驗室生物安全及個人防護應符合《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南》的要求，未經培養(yǎng)的感染性材料的操作在采用可靠方法滅活前進行核酸提取及臨床樣本滅活等操作，應在生物安全二級實驗室（BSL-2）進行，同時采用生物安全三級實驗室（BSL-3)的個人防護；感染性材料或活病毒在采用可靠方法滅活后進行的核酸檢測操作應在BSL-2進行。實驗室應符合GB19489、WS233、《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》、《江西省病原微生物實驗室生物安全管理辦法》的相關要求；個人防護則符合WS/T697的相關要求。設備核酸提取儀、PCR擴增儀、核酸定量儀、高通量測序儀。試劑核酸提取試劑盒、核酸定量試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、新冠病毒多重反應的PCR擴增試劑盒、DNA純化磁珠、文庫制備試劑盒、高通量測序試劑盒。耗材微量移液器及各種配套帶濾芯Tip頭、8聯管磁力架、1.5mLEP管、0.2mL8聯管、96孔PCR板。核酸提取根據核酸提取試劑盒說明書在核酸提取儀上提取核酸。cDNA合成以提取的核酸為模板,采用第一鏈cDNA合成試劑盒，根據試劑盒說明書在PCR擴增儀上制備第一鏈cDNA。多重PCR擴增采用新冠病毒多重PCR擴增試劑盒，根據試劑盒說明書配置多重PCR擴增引物和擴增體系，對cDNA進行多重PCR擴增。PCR產物的純化用DNA純化磁珠法對擴增產物進行純化,以TEbuffer或無核酸酶水對純化產物進行洗脫。純化產物的定量及DNA文庫制備使用核酸定量試劑盒對純化產物進行雙鏈DNA定量，根據所使用的建庫試劑盒說明書進行文庫制備。上機測序根據高通量測序試劑盒和高通量測序儀操作說明完成試劑裝載，設置測序參數進行測序。序列生成對下機數據進行質控、拼接a）去除測序數據中的PCR引物序列(按照最大引物長度30bp進行Trim)、adapter和低質量的Reads。b)對下機數據進行QC分析，判斷測序質量是否達到要求。以SARS-CoV-2參考基因組(GeneBank序列獲得號：NC_045512)為模板進行序列mapping拼接,mapping之后對測序覆蓋度和測序深度進行分析，最終生成一致性(consensus)序列，即為待溯源樣本的全基因組序列。軟件分析使用商品化新冠分析軟件，按照軟件說明書操作。結果解讀與反饋a）將待溯源樣本的全基因組序列同SARS-CoV-2參考基因組(GeneBank序列獲得號：NC_045512)進行比對，分析出突變位點。b）利用Pangolin分析工具對序列進行分析，獲得該序列屬于的變異株以及進化分支。c）將待溯源樣本的全基因組序列同本地數據庫中的本地病例及輸入病例的全基因組序列數據庫進行比對，分析是否可能為本地傳播。d）將待溯源樣本的全基因組序列同全國其他地區(qū)的序列數據庫進行比對分析，分析是否可能為外省輸入。e）根據序列分析結果，結合流行病學證據，對該待溯源樣本進行綜合分析判斷，分析引起疫情的病毒來源，得出溯源結論。參?考?文?獻中華人民共和國傳染病防治法中華人民共和國生物安全法新型冠狀病毒實驗室生物安全指南新型冠狀病毒肺炎防控方案（第九版）醫(yī)療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊江西省疾控機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南WorldHealthOrganization(2020)Surfacesamplingofcoronavirusdisease(COVID-19):apractical“howto”protocolforhealthcareandpublichealthprofessionals,18February20