蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng)

關(guān)于蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、顏色反應(yīng)2.了解蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、顏色反應(yīng)的機(jī)理。第2頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)分子中的某些基團(tuán)與顯色劑作用，可產(chǎn)生特定的顏色反應(yīng)，不同蛋白質(zhì)所含氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)亦可產(chǎn)生相同顏色反應(yīng)，因此不能僅根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果決定被測(cè)物是否是蛋白質(zhì)。顏色反應(yīng)是一些常用的蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。（一）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)原理第3頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)原理

蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如-NH3+，-COO-，-SH等和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時(shí)，就很容易被蛋白質(zhì)吸住，在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開(kāi)，顆粒之間不會(huì)碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質(zhì)在溶液中比較穩(wěn)定而不會(huì)沉淀。第4頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)能形成較穩(wěn)定的親水膠體的另一個(gè)原因，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)顆粒在非等電狀態(tài)時(shí)帶有相同電荷，使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集沉淀。

蛋白質(zhì)由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩(wěn)定的膠體。當(dāng)某些物理化學(xué)因素破壞了蛋白質(zhì)的水膜或中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。第5頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)變性后,有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在(如電荷),并不析出.因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀,而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性.第6頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和材料1.卵清蛋白液：將雞蛋白用蒸餾水稀釋20～40倍，2～3層紗布過(guò)濾，濾液冷藏備用。2.飽和硫酸銨溶液：稱硫酸銨850g加于1000mL蒸餾水中，在70～80℃下攪拌促溶，室溫中放置過(guò)夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。3.1%醋酸鉛溶液4.1%硫酸銅溶液5.0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀釋至100mL。6.濃硝酸：比重1.42。7.試管及試管架、吸管、量筒等。第7頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、操作步驟(一)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)原理：當(dāng)尿素經(jīng)加熱至180℃左右時(shí)，兩分子尿素脫去一分子氨，進(jìn)而縮合成一分子雙縮脲。在堿性條件下雙縮脲與銅離子結(jié)合成紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。多肽及蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中均含有許多肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲分子中的亞酰胺鍵相同。因此，在堿性條件下與銅離子也能呈現(xiàn)出類似于雙縮脲的呈色反應(yīng)。第8頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天第9頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)過(guò)程①取少許結(jié)晶尿素放在干燥試管中，微火加熱，尿素溶化并形成雙縮脲，釋出的氨可用紅色石蕊試紙?jiān)囍?。至試管?nèi)有白色固體出現(xiàn)，停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH溶液1mL混勻，觀察有無(wú)紫色出現(xiàn)。②另取一試管，加蛋白質(zhì)溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴，混勻，觀察是否出現(xiàn)紫玫瑰色。第10頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酷氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)(苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng))。第11頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)過(guò)程：在一試管內(nèi)，加蛋白質(zhì)溶液10滴及濃硝酸3～4滴，加熱，冷卻后再加10%NaOH溶液5滴，觀察顏色反應(yīng)。第13頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.茚三酮反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)原理：在弱酸條件下（pH5-7），蛋白質(zhì)或氨基酸與茚三酮共熱，可生成藍(lán)紫色縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)和α—氨基酸所共有(亞氨基酸如脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可發(fā)生此反應(yīng)。第14頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮;第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合成有色物質(zhì)。第15頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

取1mL蛋白質(zhì)溶液置于試管中，加2滴茚三酮試劑，加熱至沸，即有藍(lán)紫色出現(xiàn)(注意：此反應(yīng)必須在pH5～7進(jìn)行)。第16頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天(一)蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

1.鹽析作用原理

用大量中性鹽(如硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉等)，使蛋白質(zhì)沉淀析出的過(guò)程，稱為蛋白質(zhì)的鹽析作用。它包括兩個(gè)過(guò)程：一是電解質(zhì)破壞了蛋白質(zhì)的水化層而出現(xiàn)沉淀；二是電解質(zhì)中和了蛋白質(zhì)分子所帶的電荷而出現(xiàn)沉淀。中性鹽能否沉淀各種蛋白質(zhì)與中性鹽的濃度、蛋白質(zhì)的種類、溶液的pH值以及蛋白質(zhì)膠體顆粒大小有關(guān)。大顆粒蛋白質(zhì)膠體比小顆粒更容易沉淀，如球蛋白多在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。第17頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)過(guò)程

取1支試管加入3mL蛋白質(zhì)溶液和3mL飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉淀析出。過(guò)濾后向?yàn)V液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解達(dá)到飽和為止，析出的沉淀為清蛋白，再加水稀釋，觀察沉淀是否溶解。第18頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.乙醇沉淀反應(yīng)

原理：在水溶液中，蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒。在有機(jī)溶劑中，蛋白質(zhì)顆粒因失去電荷或脫水而沉淀。第19頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月25日，星期天

取1支試管架蛋白質(zhì)溶液1mL，加晶體氯化鈉少許(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL混勻。觀察有無(wú)沉淀析出。第20頁(yè),共22頁(yè)，2024年2月