制藥過程與工藝課件

緒論*1.1制藥工藝學(xué)課程地位和性質(zhì)*一課程性質(zhì)和地位*制藥業(yè)發(fā)展與挑戰(zhàn)?90年1752億USD?00年4775億USD?增長大於8%全球?4496億元,年增長大於12％?制藥業(yè)集中度↑?原料藥生產(chǎn)大國?制藥技術(shù)和裝備整體水準(zhǔn)低中國國外制藥工程教育1995年，NSF—新澤西州立大學(xué)Rutgers分?！扑幑こ萄芯可逃芪鞲髮W(xué)等高校也相繼設(shè)立制藥工程專業(yè)：TheCaliforniaStateUniversity,Fullerton;NewJerseyInstituteofTechnology;ColumbiaUniversity,NewYork;EcolePolytechniqueofMontreal;TheUniversityofLeeds;UniversityofPennsylvania;UniversityofAlabama除美國外，加拿大、英國和德國、日本和印度等國家的部分高校也已設(shè)立制藥工程教育計畫。*國內(nèi)制藥工程教育*1998年中國教育部調(diào)整新設(shè)置《制藥工程》工科本科專業(yè)化學(xué)制藥生物制藥中藥制藥……制藥工程制藥工程專業(yè)與原專業(yè)的關(guān)係*制藥工程制藥工藝學(xué)、制藥分離工程、藥品品質(zhì)管理工程、制藥設(shè)備等厚基礎(chǔ)，寬口徑，注重培養(yǎng)全面素質(zhì)與創(chuàng)新能力制藥過程共性規(guī)律、技術(shù)、學(xué)科基礎(chǔ)、發(fā)展需求化學(xué)制藥生物制藥微生物制藥中藥制藥工業(yè)製劑生物化工二研究對象與內(nèi)容*制藥工藝：從發(fā)現(xiàn)-藥物上市發(fā)現(xiàn)臨床前臨床毒理註冊生產(chǎn)GLPGCPGMP化學(xué)化學(xué)生物生物中藥劑型開發(fā)過程開發(fā)工業(yè)制藥工業(yè)制藥技術(shù)開發(fā)技術(shù)開發(fā)GLP—藥物非臨床研究品質(zhì)管理規(guī)範(fàn)GCP—藥物臨床試驗(yàn)品質(zhì)管理規(guī)範(fàn)GMP—藥品生產(chǎn)品質(zhì)管理規(guī)範(fàn)1研究對象藥物生產(chǎn)過程共性規(guī)律及其應(yīng)用，包括製備原理+工藝路線+品質(zhì)控制重要性：“安全、有效、均勻、可控”的保證藥物產(chǎn)業(yè)化的橋樑與瓶頸貫穿整個藥物研發(fā)過程*2主要內(nèi)容綜合應(yīng)用化學(xué)系列、生物系列、機(jī)械設(shè)備與工程單元操作等課程的專門知識深化理解並掌握工藝原理，去分析和解決研發(fā)和生產(chǎn)過程的實(shí)際問題。從工業(yè)生產(chǎn)角度，改造、設(shè)計和開發(fā)藥物的生產(chǎn)工藝，制定相應(yīng)的操作規(guī)程。*主要內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室（小試）工藝中試放大工藝在車間生產(chǎn)若干批號後，制定生產(chǎn)工藝規(guī)程*制藥工藝的類別（藥物分類）化學(xué)合成藥物(syntheticdrug)布洛芬、雷尼替丁、氧氟沙星…生物合成藥物(biosyntheticdrug)重組人胰島素、重組人紅細(xì)胞生成素…中藥(traditionalchinesemedicine)速效救心丸、複方丹參滴丸…*按照典型藥物生產(chǎn)過程,分為4類：化學(xué)制藥工藝學(xué)生物制藥工藝學(xué)中藥制藥工藝學(xué)製劑工藝學(xué)*1.2天然提取制藥技術(shù)發(fā)展*天然提取制藥是指直接從天然材料中使用分離純化等技術(shù)製備藥物。現(xiàn)代藥物最初來源於植物、動物和微生物，而且以提取分離為先導(dǎo)。*發(fā)展歷史15～17世紀(jì)，歐洲有了金雞納、愈創(chuàng)木、藥喇叭根、古柯果和可哥等。

19世紀(jì)，掀起了天然提取分離藥物的熱潮，從植物中分離出純的有效化學(xué)物質(zhì)。從鴉片中提取出嗎啡結(jié)晶；從吐根中分離得活性成份吐根堿。從金雞納樹皮分離得到了奎寧，成為最早用於治療瘧疾的藥物。從莨菪中提取了阿托品，從古柯葉取得了可卡因；從洋地黃葉子獲得洋地黃甙晶體。20世紀(jì)50年代後，對動物臟器的有效成分和生理活性物質(zhì)的全面瞭解，生產(chǎn)技術(shù)提高，改變了原來的混合製劑，生產(chǎn)單一特異性組分的生化藥物製劑。如豬牛胰島素、前列腺酶及輔酶、激素、脂類、蛋白質(zhì)和核酸及其降解產(chǎn)物等。生化藥物品種迅速增加，已成為一類重要的藥物。*由於合成工藝、技術(shù)等因素的限制，仍然有些氨基酸、維生素、核苷酸、酶、多糖、脂類等仍然不能合成生產(chǎn)，必須直接從天然材料中提取。還有一些手性藥物和半合成藥物的中間原料也必須從天然材料中直接提取。*1.3生物技術(shù)制藥發(fā)展*一相關(guān)定義生物技術(shù)藥物（biotechnologymedicine）是利用生物機(jī)體、組織、細(xì)胞，生產(chǎn)製造或從中分離得到的具有預(yù)防、治療和診斷功能的藥品，包括多肽、蛋白質(zhì)、酶和核酸以及具有生物活性的初級代謝和次級代謝產(chǎn)物、天然活性化合物及其類似物。生物技術(shù)藥物（biotechnologymedicine）、生物技術(shù)產(chǎn)品（biotechnologyproduct）、生物技術(shù)製品（productofpharmaceuticalbiotechnology）有時候也互換使用。在相關(guān)法規(guī)中，經(jīng)常出現(xiàn)的術(shù)語是生物製品

(biologics，biologicproduct,中國、美國使用)、生物醫(yī)藥產(chǎn)品（biologicalmedicinalproduct，歐盟使用）。*中國生物製品規(guī)程對生物製品的定義：以微生物、寄生蟲、動物毒素、生物組織為起始材料，採用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)製備，並以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品品質(zhì)製成的生物活性製劑，包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液製品、免疫球蛋白、抗原、抗體、變態(tài)反應(yīng)原、細(xì)胞因數(shù)、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品和體外免疫診斷製品等。分為預(yù)防用生物製品、治療用生物製品和診斷用品三類。預(yù)防用生物製品包括疫苗、菌苗和類毒素；治療用生物製品包括抗血清與抗毒素、血液製品、細(xì)胞因數(shù)與抗體；診斷用品包括細(xì)菌學(xué)試劑、免疫試劑、臨床化學(xué)試劑。*二生物制藥的類型微生物發(fā)酵制藥採用微生物發(fā)酵生產(chǎn)藥物。第二次世界大戰(zhàn)期間誕生了以抗生素為代表的次級代謝產(chǎn)物的工業(yè)發(fā)酵，很快應(yīng)用到其他藥物的發(fā)酵生產(chǎn)，如氨基酸、維生素、甾體激素等。微生物藥物主要為抗生素(antibiotic)、氨基酸(aminoacid)、維生素(vitamin)、核苷酸和核苷(nucleotide,nucleoside)、酶(enzyme)、酶抑制劑(enzymeinhibitor)、免疫調(diào)節(jié)劑(immunomodulator)和受體拮抗劑(receptorantagonist)等。酶工程技術(shù)制藥酶工程技術(shù)在制藥工業(yè)上的主要應(yīng)用是（1）生物酶用於製備手性藥物；（2）生物轉(zhuǎn)化，給已有藥物添加基團(tuán)，增加藥效和功能。*細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制藥動植物細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)是在離體條件下人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)動植物細(xì)胞，使之生長繁殖併發(fā)育。主要應(yīng)用於生產(chǎn)人畜病毒疫苗、單克隆抗體、重組基因工程產(chǎn)品等?；蚬こ碳夹g(shù)制藥基因工程（geneengineering）制藥是在體外通過重組DNA技術(shù)，對生物的遺傳物質(zhì)基因進(jìn)行剪切、拼接、重新組合，與適宜的載體連接，構(gòu)成完整的基因表達(dá)系統(tǒng)，然後導(dǎo)入宿主生物細(xì)胞內(nèi)，與原有遺傳物質(zhì)整合或以質(zhì)粒形式單獨(dú)在細(xì)胞中繁殖，並表達(dá)活性蛋白質(zhì)、多肽或核酸等藥物。通過基因工程改造微生物細(xì)胞的代謝過程，還可提高抗生素、維生素、氨基酸、核酸、輔酶、甾體激素等藥物的生產(chǎn)能力。*三、生物藥物的用途1作為治療藥物按藥理作用主要有以下：內(nèi)分泌障礙治療劑：胰島素、生長素、甲狀腺素等。維生素類藥物：主要起營養(yǎng)作用，用於維生素缺乏癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物：L－多巴，人工牛黃、腦啡肽。血液及造血系統(tǒng)藥物：常見的有抗貧血藥（血紅素）、抗凝藥（肝素）、纖溶劑－抗血栓藥（尿激酶）等。呼吸系統(tǒng)藥物：平喘藥（PGE、腎上腺素）、祛痰劑（乙醯半胱氨酸）、鎮(zhèn)咳藥（蛇膽、雞膽）。心血管系統(tǒng)藥物：抗高血壓藥（激肽釋放酶）、降血脂藥（彈性蛋白酶，豬去氧膽酸）、冠心病防治藥（硫酸軟骨素A）*消化系統(tǒng)藥物：助消化藥（多酶片）、潰瘍抑制劑（胃膜素、維生素U）、止瀉藥（鞣酸蛋白）。抗病毒藥物：抑制病毒核酸的合成，如碘苷抑制病毒合成酶，如阿糖腺苷調(diào)節(jié)免疫功能，如干擾素抗腫瘤藥物：主要有核酸類抗代謝物（阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶）、抗癌天然大分子（天冬醯胺酶，香菇多糖PSK，灰樹花多糖）、提高免疫力抗癌劑（白介素－2,干擾素）抗輻射藥物：如超氧歧化酶（SOD）計劃生育用藥：口服避孕藥（複方炔諾酮）生物製品類治療藥：各種免疫蛋白、抗毒素、抗血清（蛇毒抗血清）。*2作為預(yù)防藥物常見的預(yù)防藥物有菌苗、疫苗、類毒素及冠心病防治藥物。3作為診斷藥物（1）免疫診斷試劑利用高度特異性和敏感性的抗原機(jī)體反應(yīng)，檢測樣品中有無相應(yīng)的抗原或抗體，可作為臨床診斷的依據(jù)。主要有診斷抗原和診斷血清。診斷抗原：細(xì)菌類，如傷寒病毒類，如SARS，乙肝病毒毒素類，如鏈球菌溶血素O*

診斷血清：細(xì)菌類病毒類腫瘤類抗毒素類激素類血型及人類白細(xì)胞抗原診斷血清其他（2）酶診斷試劑利用酶反應(yīng)的專一性和快速靈敏的特點(diǎn)，定量測定體液內(nèi)的某一成分變化作為病情診斷的參考。目前有40餘種酶診斷試劑盒。*（3）器官功能診斷藥物利用某些藥物對器官功能的刺激作用，排泄速度等已檢查器官的功能損害程度。如甘露醇等。（4）放射性核素診斷藥物放射性核素診斷藥物有聚集於不同組織或器官的特性，故加入體內(nèi)後，可檢測其在體內(nèi)的吸收、分佈、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用及排泄等情況，從而顯示器官功能及其形態(tài)，以供疾病的診斷。（5）診斷用單克隆抗體（McAb）McAb的特點(diǎn)之一是專一性強(qiáng)，一個B細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體只針對抗原分子上的一個特定抗原決定族。*（四）用作其他生物醫(yī)藥用品生化試劑如細(xì)胞培養(yǎng)基、電泳試劑等生物醫(yī)學(xué)材料手術(shù)縫合線、人造骨頭等。營養(yǎng)保健品和美容化妝品*1.4化學(xué)合成制藥技術(shù)發(fā)展*全合成制藥磺胺嘧啶、阿司匹林…半合成制藥多烯紫杉醇、頭孢類抗生素…手性制藥阿托伐他汀、阿奇黴素…*化學(xué)制藥工藝的要求最安全：易燃易爆、有毒的原料與中間體最經(jīng)濟(jì)：成本最低最便捷：工藝路線最短，最簡，易於組織生產(chǎn)綠色工藝：三廢，廢水、氣、渣*1.5制藥工業(yè)的發(fā)展*一全球制藥工業(yè)的發(fā)展制藥工業(yè)（pharmaceuticalindustry）的歷史大約70多年，但一開始就發(fā)展很快，目前全世界制藥企業(yè)超過10000家，生產(chǎn)製造5000多種藥物，其中約100家為跨國公司。20世紀(jì)初所用藥物只有四種：洋地黃用於治療各種心血管疾病，奎寧用於治療瘧疾，吐根屬植物提取物（活性成分為生物堿）用於治療痢疾，水銀用於治療梅毒，但當(dāng)時缺乏安全性和有效性。20世紀(jì)70年代以後，出現(xiàn)現(xiàn)代生物技術(shù)制藥公司。目前，全世界生物技術(shù)公司4400多家，主要集中在歐美，美國1444家，歐洲1815家，加拿大472家，亞太地區(qū)685家。年產(chǎn)值超過10億美元的生物技術(shù)公司有20餘家。*世界制藥行業(yè)具有以下特徵並購風(fēng)雲(yún)不斷，重組形成更大集團(tuán)，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合優(yōu)勢互補(bǔ)，戰(zhàn)略性驅(qū)動，企業(yè)經(jīng)營的專業(yè)化，企業(yè)間的合作。並購數(shù)量增加，藥品生產(chǎn)的集中度不斷提高。研發(fā)費(fèi)用持續(xù)上升，投入繼續(xù)增大，國際10大制藥公司的年均投入占銷售額的16％左右。1個新藥的研發(fā)費(fèi)用約8－10億美元，但新藥批準(zhǔn)上市的數(shù)目在下降。研發(fā)的難度越來越大，新產(chǎn)品是行業(yè)的希望。重磅炸彈藥物數(shù)目持續(xù)增加，從1995年到2004年，增長了近4倍。跨國公司更多依賴於重磅炸彈藥物，是企業(yè)的主要利潤來源。生物技術(shù)藥物異軍突起。20世紀(jì)80年代以前是治療性藥物，20世紀(jì)90年代是改善生命品質(zhì)的藥物，而進(jìn)入21世紀(jì)，將是靶向的蛋白質(zhì)、多肽和核酸類治療性藥物。*二我國制藥工業(yè)發(fā)展中國制藥工業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了從藥店到廠房，再到現(xiàn)代化企業(yè)和集團(tuán)的過程。20世紀(jì)20～30年代，上海、廣州是我國近代制藥工業(yè)的發(fā)祥地，但制藥工業(yè)十分落後。1949年新中國成立初期，重視醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，確定了“以發(fā)展原料藥為主”的方針。同時，積極發(fā)展藥物製劑生產(chǎn)。1951年試製出第一批結(jié)晶青黴素，1958年，以生產(chǎn)抗生素為主的華北制藥廠建成投產(chǎn)；至1959年，中國建立起化學(xué)制藥工業(yè)。20世紀(jì)80年代後，走上了按正規(guī)制藥工業(yè)管理和發(fā)展的道路。*1.6制藥技術(shù)展望*制藥行業(yè)是一個集約化、國際化程度極高的產(chǎn)業(yè)。國外公司在中國設(shè)立研發(fā)機(jī)構(gòu)，並把生產(chǎn)製造中心向中國轉(zhuǎn)移。“十一五”時期乃至更長時間我國醫(yī)藥市場需求將繼續(xù)保持旺盛勢頭。中國醫(yī)藥市場今後5年內(nèi)將以15％～20％的速度發(fā)展，到2010年將達(dá)到240億美元，成為繼美國、日本、德國和法國之後的世界第5大醫(yī)藥市場，2020年將達(dá)到1200億美元，超過美國成為全球第一大市場。從制藥業(yè)各子行業(yè)看，未來5～10年期間，我國醫(yī)藥市場將繼續(xù)保持以化學(xué)藥為主，生物技術(shù)制藥已經(jīng)成為制藥行業(yè)的新領(lǐng)域，天然提取制藥有很大發(fā)展空間。主要途徑為：創(chuàng)新藥物研究、抗體工程制藥技術(shù)、制藥工藝新技術(shù)及其改造。*創(chuàng)新藥物研究加大制藥的科研開發(fā)投入，研究並擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的藥物和技術(shù)。我國現(xiàn)有常用西藥4000多種，其中97％屬於仿製國外產(chǎn)品或進(jìn)口藥。採用組合生物化學(xué)、生物分子晶片、細(xì)胞組織和動物模型等高通量的方法篩選天然藥物，發(fā)現(xiàn)新型治療藥物。利用人類基因組和蛋白質(zhì)組以及病原生物體的基因組的最新成果，電腦技術(shù)，把生物資訊學(xué)、分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)藥學(xué)、藥物化學(xué)、藥理學(xué)等的技術(shù)綜合起來，通過突變、生物展示、嵌合、質(zhì)譜分析等，進(jìn)行新型藥物的輔助設(shè)計和藥物篩選，獲得創(chuàng)新性藥物。通過基因工程技術(shù)，改變重組蛋白類藥物的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)活性，延長體內(nèi)的半衰期。利用生物分子修飾化學(xué)藥物。如利用人白蛋白製成的納米顆粒結(jié)合紫杉醇注射製劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的紫杉醇製劑可避免過敏反應(yīng)，加強(qiáng)了紫杉醇的臨床效果和安全性。*抗體工程制藥技術(shù)FDA批準(zhǔn)上市的生物藥物中，抗體類藥物所占比例越來越大，2004年有11個，3個為全新藥物，其他為新適應(yīng)癥?？贵w類藥物一上市就成為年銷售額逾億美元的重磅炸彈藥(blockbusterdrug)?；秵慰寺】贵w的治療劑主要的應(yīng)用領(lǐng)域是癌癥，上市的抗體藥物一半都在營利。預(yù)計單抗藥物的全球銷售額將從2004年的50多億美元增至2010年的150億美元，平均年增長30%。*制藥工藝新技術(shù)及其改造應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)改造我國傳統(tǒng)的醫(yī)藥工業(yè)，使我國制藥行業(yè)的經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)由速度型向效益型、由粗放型向集約型的根本轉(zhuǎn)變，用先進(jìn)的製造技術(shù)進(jìn)行藥物生產(chǎn)。研究適用於大規(guī)模藥物生產(chǎn)的動植物和微生物表達(dá)系統(tǒng)，提高藥物生產(chǎn)效率的新途徑。大力開發(fā)手性藥物及外消旋藥物的手性轉(zhuǎn)化。加強(qiáng)環(huán)境保護(hù)與品質(zhì)意識。*

微生物發(fā)酵制藥工藝2.1微生物發(fā)酵與制藥*一發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青黴素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機(jī)酸。次級代謝產(chǎn)物：比較複雜的化合物，不是細(xì)胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）?？股兀舅?，色素。*發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵微生物菌體發(fā)酵是以獲得微生物菌體為目的，如：麵包的酵母發(fā)酵、單細(xì)胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇雲(yún)金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發(fā)酵微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青黴素醯化酶，用於半合成青黴素時，製備中間體6－氨基青黴烷酸。微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機(jī)酸。次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價值的產(chǎn)物的生化反應(yīng)為轉(zhuǎn)化發(fā)酵。*制藥微生物的種類生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細(xì)菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細(xì)菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacteriumflarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈黴菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈黴素、新黴素、卡那黴素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金黴素、土黴素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環(huán)內(nèi)酯類（紅黴素、螺旋黴素、柱晶白黴素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類（制黴菌素、抗滴蟲黴素等）。酸性、鹼性和中性，但以鹼性為多。真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔黴素，青黴素菌屬產(chǎn)生青黴素和灰黃黴素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢黴素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。*發(fā)酵制藥的基本過程*菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子製備種子製備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實(shí)驗(yàn)室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間2.3制藥微生物菌種的建立*新藥生產(chǎn)菌的選育自然分離自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術(shù)育種基因組shuffling技術(shù)*2.8抗生素生產(chǎn)工藝*以青黴素為例一概述－發(fā)現(xiàn)1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的黴菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法分離並用作藥物。

1939：牛津病理家HowardFlorey化學(xué)家ErnstChain,NormanHeatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)黴菌，培養(yǎng)裏提取，測活性，青黴素結(jié)晶。*發(fā)展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個單位。深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青黴：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產(chǎn)色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。*概述－作用機(jī)理細(xì)胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨醯-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細(xì)胞有效，靜止細(xì)胞無效高效、安全的抗細(xì)菌感染藥物*概述－應(yīng)用臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。各種半合成抗生素的原料：氨芐青黴素，磺芐青黴素，乙氧萘青黴素頭孢菌素母核。*二青黴素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性產(chǎn)黃青黴：Penicilliumchrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。*青黴穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。發(fā)酵條件下的生長過程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜鹼性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機(jī)理貯藏物，沒有空泡，嗜鹼性很強(qiáng)。第4期：脂肪包涵體形成小滴並減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜鹼性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青黴素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個別自溶細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。*鏡檢規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。*三發(fā)酵工藝過程*1生產(chǎn)孢子製備工斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白腖組成的固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25℃。注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測定效價及雜菌情況。*2種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度27±1℃,40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h品質(zhì)：菌絲緻密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h*3生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％。培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙醯胺，CaCO3,玉米油,矽油。參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時:pH6.4-6.6，26℃；60小時後:pH6.7,24℃。*4發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵。發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3。帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵週期：180-220h。*（1）過程控制——補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物40小時後：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。碳源占成本12％以上，採用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青黴素產(chǎn)量。*流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動範(fàn)圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。濃度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3·h。*流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補(bǔ)加無機(jī)氮源：硫酸銨、氨水、尿素。氨基氮濃度：0.01-0.05%。*鹽離子控制無機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青黴素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁塗環(huán)氧樹脂保護(hù)層。*（2）添加青黴素側(cè)鏈前體時期：合成階段。種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙醯胺、苯乙胺、苯乙醯甘氨酸。毒性：抑制細(xì)胞生長和青黴素合成。策略：低濃度流加。濃度：苯乙酸0.1%，苯乙醯胺0.05-0.08%。控制：保持供應(yīng)速率略大於生物合成需要。*提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護(hù)劑；分散劑*（3）溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青黴素20℃。20℃青黴素破壞少，週期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利於青黴素合成。前期控制26℃左右，後期降溫控制24℃。*（4）pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）*（5）溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧。調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同。*（6）消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。*四提煉工藝過程青黴素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶於有機(jī)溶劑，水中溶解度很小青黴素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。*1預(yù)處理青黴素的存在部位：發(fā)酵液。濃度較低：10－30kg/m3。含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等。目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特徵，利於後續(xù)的分離純化過程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉澱蛋白。*2過濾鼓式真空過濾機(jī)過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過濾機(jī)過濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%矽藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用於提?。ㄊ章?0％）*3、溶劑萃取原理：青黴素游離酸易溶於有機(jī)溶劑，而黴素鹽易溶於水。萃取劑：青黴素分配係數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃?。?－3次。*逆流萃取過程正相萃?。核峄痯H1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機(jī)分離（濃縮1.5-2.1）反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩衝液）。把青黴素從丁酯中提取到緩衝液中。反復(fù)萃取2－3次，達(dá)到結(jié)晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。*4脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。過濾，除去活性炭。*5結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青黴素鉀鹽。*5結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過洗滌、乾燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青黴素產(chǎn)品。*2.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝*一氨基酸類藥物得基本概念*α氨基酸氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)係必需氨基酸—人和哺乳動物自身不能合成，需要由食物供應(yīng)，稱為必需氨基酸。賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等8種。治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其鹽酸鹽，穀氨醯胺，乙醯穀醯胺鋁，甘氨酸及其鋁鹽，硫酸甘氨酸鐵，維生素U及組氨酸鹽酸鹽等。治療肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸鹽酸鹽，磷葡精氨酸，鳥天氨酸，谷氨酸鈉，蛋氨酸，乙醯蛋氨酸，瓜氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，及天冬氨酸等。*治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸鈣鹽及鎂鹽，氫溴酸谷氨酸，色氨酸，5－羥色氨酸、左旋多巴等。用於腫瘤治療的氨基酸及其衍生物偶氮絲氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其他氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用*二氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法1發(fā)酵法2水解法3酶法轉(zhuǎn)化*1發(fā)酵法L－異亮氨酸的製備*培養(yǎng)液滅菌滅菌培養(yǎng)液菌種培養(yǎng)接種發(fā)酵發(fā)酵液過濾上層液酸化濾液離子交換洗脫液減壓蒸餾濃縮液活性炭脫色濾液減壓濃縮濃縮液氨水中和沉澱水結(jié)晶乾燥L(fēng)－異亮氨酸成品工藝過程1）菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（％）為：葡萄糖2，尿素0.3，玉米漿2.5，豆餅水解液0.1，pH6.5。二級種子培養(yǎng)基加菜籽油，其餘同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)：1000ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30℃16h。二級種子培養(yǎng)：接種量3.5％，培養(yǎng)8h。逐級放大。2）滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（％）：硫酸銨4.5，豆餅水解液0.4，玉米漿2.0，碳酸鈣4.5，pH7.2，澱粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種1％菌種（v/v），攪拌，發(fā)酵。*3）除菌體，酸化發(fā)酵結(jié)束後，發(fā)酵液加熱至100℃並維持10min，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉澱。4）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5％的流速進(jìn)H＋型732離子交換柱（φ40×100cm),以100L去離子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速進(jìn)行洗脫。分部收集洗脫液。5）濃縮趕氨6）脫色、濃縮、中和7）精製，烘乾*1水解法（一）基本原理蛋白質(zhì)水解方法酸水解法、堿水解法、酶水解法氨基酸分離方法溶解度法、特殊試劑沉澱法、吸附法、離子交換法氨基酸精製方法結(jié)晶，重結(jié)晶*水解法舉例L－胱氨酸的製備：*人發(fā)或豬毛水解液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸鹽酸水解氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭中和，氨水3酶法轉(zhuǎn)化*延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化液L－Asp粗品分離L-Asp精品轉(zhuǎn)化液固定化L－Asp－β－脫羧酶濃縮結(jié)晶L－Ala粗品L－Ala精品精製天冬氨酸和丙氨酸的製備工藝過程1）菌種培養(yǎng)大腸桿菌（E.coli）AS1.881的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)基成分（％）：玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸鎂（7水）0.02，氨水調(diào)pH6.0，煮沸後過濾，500ml三角燒瓶中裝液量50-100ml。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種子於搖瓶培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)24h，逐級擴(kuò)大培養(yǎng)至1000～2000ml規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束後用1mol/LHCl調(diào)pH5.0，升溫至45℃並保溫1h，冷卻至室溫，離心收集菌體。德阿昆哈假單胞（Pseudomonasdacunhae）68變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（％）為蛋白腖0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量40ml。搖瓶培養(yǎng)基組成（％）為L－谷氨酸3.0，蛋白腖，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氫鉀0.05，MgSO4.7H2O0.01，用氨水調(diào)pH7.2，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種於種子培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)8h，再接種於搖瓶培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)24h，逐級放大。*2）細(xì)胞固定化Ecoli的細(xì)胞固定化取濕菌體20kg，懸浮於生理鹽水中，保溫至40℃，再加入90L保溫至40℃的12％明膠溶液及10L1.0％戊二醛溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，放置冷卻凝固，再浸入0.25％戊二醛溶液中。於5℃過夜後，切成3～5mm的立體小方塊，浸入0.25％戊二醛溶液5℃過夜，蒸餾水充分洗滌，濾幹得含天冬氨酸酶得固定化。假單胞菌體固定取濕菌體20kg，加生理鹽水?dāng)嚢柚料♂屩?0L，另取溶於生理鹽水的5％角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫至45℃後混合，冷卻至5℃成膠。浸於600L2％KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/LpH7.0的磷酸緩衝液中，5℃下攪拌10min，加戊二醛至0.6mol/L濃度，5℃攪拌30min，取出切成3～5mm的立體方塊，用2％KCl溶液充分洗滌後，濾去洗滌液，即得固定化脫羧細(xì)胞。*3）生物反應(yīng)堆的製備4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)5）產(chǎn)品純化與精製*4化學(xué)合成法L－脯氨酸**L－谷氨酸＋乙醇硫酸三乙胺L－谷氨酸－γ－乙酯KBH4還原L－Pro反應(yīng)液五氯酚沉澱氨水解析濾液活性炭濾液乙醚固形物精製L－脯氨酸成品2.10維生素生產(chǎn)工藝*一概述維生素是一類生物生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的、化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的、小分子有機(jī)化合物，人體內(nèi)不能合成，必須從食物等中攝取。人體需求量很少，但不足時，出現(xiàn)相應(yīng)的缺乏癥。已知維生素13種，根據(jù)溶解性，一般分為水溶性和脂溶性維生素兩類。主要維生素的生產(chǎn)有三種方法。2002年我國維生素原料產(chǎn)量達(dá)8.2萬噸，其中維生素C超過5萬噸，成為世界上最大的原料藥生產(chǎn)國和出口國。維生素製劑年產(chǎn)量260－280億支/片/瓶，以片劑、注射液和膠囊為主。*2維生素C生產(chǎn)工藝目前，工業(yè)上生產(chǎn)維生素C採用二步發(fā)酵法，此法是在1975年由中國科學(xué)院上海生物技術(shù)研究所研究出來的，屬我國首創(chuàng)。發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C可以分為發(fā)酵、提取和轉(zhuǎn)化三大步驟。即先從D-山梨醇發(fā)酵，提取出維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，再用化學(xué)法轉(zhuǎn)化為維生素C。第一步發(fā)酵黑醋酸菌（Acetobactersuboxydans）經(jīng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基主要包括山梨醇、玉米漿、酵母膏、碳酸鈣等成份，pH5.0~5.2。醇濃度控制在24~27%，培養(yǎng)溫度29~30℃，發(fā)酵結(jié)束後，發(fā)酵液經(jīng)低溫滅菌，移入第二步發(fā)酵罐作原料。D-山梨醇轉(zhuǎn)化L-山梨糖的生物轉(zhuǎn)化率達(dá)98%以上。*第二步發(fā)酵氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans，小菌)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium，大菌)混合培養(yǎng)。生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵罐均在100m3以上，瘦長型，無機(jī)械攪拌，採用氣升式攪拌。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的成份類似,主要有L-山梨糖、玉米漿、尿素、碳酸鈣、磷酸二氫鉀等，pH值為7.0。大、小菌經(jīng)二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，接入含有第一步發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，29~30℃下通入大量無菌空氣攪拌，培養(yǎng)72h左右結(jié)束發(fā)酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)70~85%。

2-酮基-L-古龍酸的分離提純經(jīng)二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以後，發(fā)酵液中僅含8%左右的2-酮基-L-古龍酸，且殘留菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮的固體顆粒等雜質(zhì)，常採用加熱沉澱法、化學(xué)凝聚法、超濾法分離提純。傳統(tǒng)工藝是加熱沉澱法，發(fā)酵液經(jīng)靜置沉降後通過732氫型離子交換樹脂柱，調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，並加熱使蛋白質(zhì)凝固，然後用高速離心機(jī)分離出菌絲、蛋白和微粒，清液再次通過陽離子交換柱，酸化為2-酮基-L-古龍酸的水溶液，濃縮結(jié)晶後得到2-酮基-L-古龍酸。*2-酮基-L-古龍酸的化學(xué)轉(zhuǎn)化將維生素C前體2-酮基-L-古龍酸轉(zhuǎn)化為維生素C，常採用堿轉(zhuǎn)化法。2-酮基-L-古龍酸在甲醇中用濃硫酸催化酯化生成2-酮基-L-古龍酸甲酯，加NaHCO3轉(zhuǎn)化生成維生素C鈉鹽，經(jīng)氫型離子交換樹脂酸化得到維生素C。粗品經(jīng)結(jié)晶精製得維生素C成品。*3維生素B2生產(chǎn)工藝維生素B2（vitaminB2）又稱核黃素(riboflavin)，國內(nèi)約有l(wèi)0家核黃素生產(chǎn)商。目前國內(nèi)外廣泛採用微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)維生素B2。能夠產(chǎn)生維生素B2

的微生物有細(xì)菌、真菌和黴菌，工業(yè)生產(chǎn)中主要以阿舒假囊酵母(Eremothereciumashbyii)為生產(chǎn)菌種。維生素B2

的工業(yè)發(fā)酵一般為二級發(fā)酵，發(fā)酵液先沉澱再氧化進(jìn)行分離提純。*發(fā)酵培養(yǎng)基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米等作為主要碳源，植物油中以豆油對維生素B2產(chǎn)量的促進(jìn)效果最為顯著,有機(jī)氮源以蛋白腖、骨膠、魚粉、玉米漿為主，無機(jī)鹽有NaCl、K2HPO4、MgSO4。種子擴(kuò)大培養(yǎng)和發(fā)酵的通氣量要求均比較高，通氣比一般在1.0，罐壓0.05MPa左右，攪拌功率要求比較高。阿舒假囊酵母的最適生長溫度在28~30℃，種子培養(yǎng)34~38h後接入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)40h後開始連續(xù)流加補(bǔ)糖，發(fā)酵液的pH值控制在5.4~6.2,發(fā)酵週期為150~160h。維生素B2的產(chǎn)量在50g/L左右。維生素B2的分離提取與純化發(fā)酵液酸化後加熱,然後加入黃血鹽、硫酸鋅沉澱蛋白，過濾後濾液調(diào)pH1.5~2.0酸化，靜置20~40h沉澱，壓濾後將沉澱物酸溶，加入硝酸銨，氧化抽提，氧化液經(jīng)結(jié)晶、過濾後，濕晶在80℃以下乾燥20h，得到維生素B2成品。*

基因工程制藥工藝3.1基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)*基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達(dá)外源基因或過量或抑制表達(dá)自身基因的工程生物體。種類：細(xì)菌和酵母是重要的表達(dá)重組藥物的制藥生物。*一大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1大腸桿菌（Eschericliacoli）形態(tài)特徵*細(xì)胞：G－，單細(xì)胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2－3mm。2生化與遺傳特性能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機(jī)鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕－12株的衍生菌株。基因組：4.6Mb，3000多種蛋白質(zhì)。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒。*3質(zhì)粒載體*複製起始點(diǎn)選擇標(biāo)記多克隆位點(diǎn)質(zhì)粒類型嚴(yán)緊型質(zhì)粒：在每個宿主細(xì)胞只能複製少數(shù)幾個拷貝的質(zhì)粒，pSC101；鬆弛型質(zhì)粒：在每個細(xì)胞中能複製幾十至幾百個拷貝數(shù)的質(zhì)粒，pMB1和colE1；克隆質(zhì)粒：用於克隆和擴(kuò)增外源基因；測序質(zhì)粒：用於基因測序；整合質(zhì)粒：用於外源基因與宿主染色體整合；穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細(xì)胞存在；表達(dá)質(zhì)粒：能表達(dá)基因產(chǎn)物*4產(chǎn)物表達(dá)形式不溶性蛋白質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體；可溶性蛋白質(zhì)：存在於細(xì)胞質(zhì)；周質(zhì)表達(dá)：外源蛋白被運(yùn)輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利於分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸；胞外分泌表達(dá)：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。*5優(yōu)點(diǎn)和不足發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)。具有遺傳背景清楚、目標(biāo)基因表達(dá)水準(zhǔn)高（高達(dá)70％），培養(yǎng)週期短，抗污染能力強(qiáng)。不能用於加工修飾化（糖基化、醯胺化）蛋白表達(dá)。細(xì)胞死亡後，細(xì)胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反應(yīng)。*6應(yīng)用大量外源基因能超量的表達(dá)，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素(1種PEG化)細(xì)胞因數(shù)類：5種干擾素α（1種PEG化）、干擾素β和γ，2種G-CSF(1種PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：rPA白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。*二酵母表達(dá)系統(tǒng)1形態(tài)特徵*細(xì)胞：單細(xì)胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。2生長與遺傳特徵孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細(xì)胞，兩個性別不同的單倍體細(xì)胞結(jié)合形成二倍體接合子或營養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體1996年完成其全基因組測序，遺傳背景已相當(dāng)清楚?；蚪M：120.68Mb，5887個ORF，編碼約6000個基因。*3優(yōu)點(diǎn)與不足優(yōu)點(diǎn)五種類型的載體，——安全、無毒。營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒。培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。亞細(xì)胞器分化，進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯後正確修飾和加工，並具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點(diǎn)釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會引起副作用。*4應(yīng)用1981年Hitzman等：酵母表達(dá)人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素細(xì)胞因數(shù)：GM-CSF和血小板衍生生長因數(shù)多肽類：高血糖素2種乙肝疫苗等。8種產(chǎn)品*3.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建技術(shù)*一工程菌構(gòu)建流程*目標(biāo)基因克隆表達(dá)載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化與篩選工程菌PCR、文庫、化學(xué)合成酶切、連接外源基因?qū)肱c培養(yǎng)二表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體設(shè)計目標(biāo)基因的定位克隆酶切反應(yīng)連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化篩選與鑒定*三基因工程菌的建立過程適宜宿主菌的轉(zhuǎn)化篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等。目標(biāo)獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達(dá)的載體，確保藥物的生物活性。*表達(dá)篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達(dá)篩選誘導(dǎo)表達(dá)時間和誘導(dǎo)強(qiáng)度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場所的鑒定表達(dá)部位胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；包涵體，可溶性蛋白表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性鑒定電泳，SDS－PAGE，等電點(diǎn)電泳免疫雜交，末端測序，質(zhì)譜分析分析與目標(biāo)產(chǎn)物的同一性*3.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制*一培養(yǎng)基組成與控制碳源氮源無機(jī)鹽選擇劑誘導(dǎo)物*1碳源大腸桿菌：蛋白腖等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機(jī)物如甘油等對菌體生長具有一定的促進(jìn)作用。濃度稍高後就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會造成培養(yǎng)基的酸化。*2氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機(jī)氮源。不同工程菌對氮源利用能力差異很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機(jī)氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源*3、無機(jī)鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)。*4選擇劑selectiveagent維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿主菌。為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性、不丟失，根據(jù)質(zhì)粒上的營養(yǎng)缺陷或選擇性標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。*選擇劑種類營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗生素抗性。工程大腸桿菌：卡那黴素、氨芐青黴素、氯黴素、博來黴素等抗生素作為選擇劑；工程酵母菌：氨基酸營養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。*5

誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌：在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達(dá)必不可少的。Lac啟動子表達(dá)系統(tǒng)：IPTG誘導(dǎo)。甲基營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。*6培養(yǎng)基組成對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基，質(zhì)粒穩(wěn)定性高於合成培養(yǎng)基；限制性基質(zhì)對基因工程菌的比生長速率有不同影響；大腸桿菌對葡萄糖和磷酸鹽限制易發(fā)生質(zhì)粒不穩(wěn)定，有一些質(zhì)粒對氮源、鉀、硫等表現(xiàn)不穩(wěn)定；對於酵母，極限培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利於維持質(zhì)粒穩(wěn)定性；培養(yǎng)基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利於提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。*二培養(yǎng)工藝與控制溫度溶解氧pH*1溫度對工程菌發(fā)酵的影響生長大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為10℃；大腸桿菌生長最適溫度為37℃，最高溫度為45℃；釀酒酵母生長最適溫度為30℃，最高溫度為40℃。生產(chǎn)生長與生產(chǎn)溫度不一致；較高溫度表達(dá)包涵體，較低溫度下有利於表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)；對於熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可採用先高溫，然後低溫，變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)降解。*溫度控制兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；後期：較低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：生長期維持37℃，生產(chǎn)期提高溫度42℃。*2pH值對發(fā)酵的影響細(xì)菌喜歡偏鹼性：大腸桿菌適宜pH為6.5～7.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0～6.0。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在鹼性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利於發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達(dá)。*pH控制瞭解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以後，需要進(jìn)一步設(shè)法控制pH在合適的範(fàn)圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來確定生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達(dá)到最佳生產(chǎn)。*3溶解氧控工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力。考慮溶氧對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量來調(diào)控*三終點(diǎn)控制根據(jù)目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)模式而定。適宜的誘導(dǎo)時間：非常重要誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵溫度：影響表達(dá)量，產(chǎn)物存在形式在生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制。*1

化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子：lac、tac、T7等誘導(dǎo)時間：對數(shù)生長期細(xì)菌：IPTG誘導(dǎo)甲基營養(yǎng)型酵母：甲醇誘導(dǎo)。*2溫度誘導(dǎo)表達(dá)溫度誘導(dǎo)型啟動子：PL、PR啟動子兩段培養(yǎng)發(fā)酵：誘導(dǎo)時間：菌體生長的對數(shù)期或稍後一些，升高溫度，合成產(chǎn)物。*3.4重組人干擾素生產(chǎn)工藝*一干擾素概述概念：（interferon，IFN）機(jī)體受到病毒感染時，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細(xì)胞因數(shù)功能：干擾病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖天然干擾素分類：I干擾素：IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNε、IFNω

II干擾素：IFNγ上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ研發(fā)中的重組干擾素：IFNω，臨床階段*重組干擾素的臨床應(yīng)用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ*干擾素生產(chǎn)工藝路線體外誘生干擾素製備工藝：Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝基因工程大腸桿菌假或單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝動物無限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝*二生產(chǎn)過程工程菌的構(gòu)建發(fā)酵過程產(chǎn)物分離和純化*1工程菌的構(gòu)建第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建*2干擾素的發(fā)酵工藝過程*工作菌種庫藥瓶培養(yǎng)種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)菌體收集3干擾素的分離純化工藝過程(1)菌體裂解裂解緩衝液：純化水，2℃～10℃（pH7.5）；使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF；破碎－20℃菌體：2釐米；攪拌：加裂解緩衝液，2℃～10℃，2h；凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。*(2)預(yù)處理加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌，對菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌，對菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉澱。離心連續(xù)流離心機(jī)：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉澱：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。*(3)初級分離鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min。保存：收集沉澱，粗干擾素，4℃。*(4)干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉澱與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝*

動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝4.1制藥動物細(xì)胞*一動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能*細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核沒有細(xì)胞壁亞細(xì)胞器動物細(xì)胞培養(yǎng)的代謝特徵葡萄糖和穀氨醯氨：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制葡萄糖限制：通過增加穀氨醯氨消耗得以補(bǔ)償，反之通過增加穀氨醯氨消耗得以補(bǔ)償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外並在培養(yǎng)液中積累。另一條途徑為TCA迴圈，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對細(xì)胞有毒性。*Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以補(bǔ)償。離體動物細(xì)胞系，轉(zhuǎn)氨作用是主要代謝途徑。穀氨醯胺在脫氨酶的催化下，脫氨產(chǎn)生氨，對細(xì)胞有毒性。穀氨醯氨與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進(jìn)入培養(yǎng)液並積累。Gln能量：Glu轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進(jìn)入TCA迴圈。流加葡萄糖或穀氨醯氨，控制整個代謝過程，避免有毒廢物的積累。*蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達(dá)蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體糖基化場所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾。不同細(xì)胞系糖基化特徵不同，選擇適宜細(xì)胞系。對於分泌型蛋白，分泌泡與細(xì)胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。*二制藥動物細(xì)胞的種類目前用於制藥的動物細(xì)胞有4類：原代細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系異倍體細(xì)胞系融合的或重組的工程細(xì)胞系*細(xì)胞系分類來源：原代細(xì)胞，傳代細(xì)胞。壽命：有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系。染色體數(shù)目：二倍體細(xì)胞系，異倍體細(xì)胞系。獲得方式：工程細(xì)胞系，癌變細(xì)胞系。生長特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細(xì)胞系。*4.2動物細(xì)胞的生產(chǎn)特徵*一對培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感無細(xì)胞壁保護(hù)，細(xì)胞膜直接接觸外界。物理化學(xué)因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細(xì)菌和植物細(xì)胞相比，動物細(xì)胞培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格地多。*1溫度哺乳動物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為37℃雞細(xì)胞為39℃～40℃；昆蟲類細(xì)胞為25℃～28℃。耐受溫度範(fàn)圍較窄，35℃～37℃細(xì)胞受傷：39℃～40℃1小時，但能恢復(fù)。受傷嚴(yán)重：41℃～42℃，部分可恢復(fù)。死亡：43℃以上。*2氧氣動物細(xì)胞生長必須有氧氣，缺氧時不能生存。離體培養(yǎng)的氣體：含有5％CO2和95％空氣，其中氧濃度為中氧濃度為21％。高氧環(huán)境：O2濃度60%以上，對細(xì)胞毒性較大，抑制生長和增殖，出現(xiàn)染色體異常等現(xiàn)象。有時充以有時充以N2氣稀釋O2濃度。*3pH值低於6.8或超過7.6會對細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重影響甚至使細(xì)胞死亡。機(jī)體細(xì)胞的pH範(fàn)圍為6～8，而且在血液和體液中，變化範(fàn)圍很小。人體：血液pH比較恒定，7.36～7.44。低於7.05發(fā)生酸中毒，高於7.45發(fā)生堿中毒。*4滲透壓正常血漿滲透壓為280～310mOsm/kg高滲溶液：高於310mOsm/kg低滲透壓溶液：低於280mOsm/kg。動物細(xì)胞對滲透壓有較強(qiáng)的耐受性離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液。增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/mlNaCl，滲透壓增加32mOsm/kg。*二對培養(yǎng)基組成要求高動物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高完全異養(yǎng)，容易利用、相對低分子量的營養(yǎng)物12中必需氨基酸8種以上維生素多種無機(jī)鹽和微量元素多種附加成分：生長類、細(xì)胞因數(shù)和貼壁因數(shù)因數(shù)及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)能源：單糖，葡萄糖，穀氨醯氨氮源：氨基酸單體化合物*三天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物完善的翻譯後蛋白質(zhì)修飾功能游離核糖體：合成細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)。與膜結(jié)合的核糖體：合成分泌性和膜整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。修飾：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，高爾基體加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌，糖鏈。糖基化、磷酸化、醯胺化等?；钚苑肿樱貉b配折疊形成精確的三維結(jié)構(gòu)。*四生產(chǎn)工藝特徵產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適於臨床使用動物細(xì)胞生產(chǎn)：70％蛋白質(zhì)藥物。培養(yǎng)工藝：難度大，產(chǎn)量低，成本高。胞外分泌產(chǎn)物：分離純化簡單。有潛在的血源性污染危險。*4.3動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)*一細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性生長基質(zhì)接觸抑制貼壁依賴性細(xì)胞非貼壁依賴性細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞*1生長基質(zhì)概念：growthsubstratum把改變生長表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)。胞外基質(zhì)成分：多聚賴氨酸膠原*2接觸抑制概念：contactinhibition細(xì)胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸彙集成片，當(dāng)每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖。特點(diǎn)：保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時間，但細(xì)胞密度不再增加。有：大多數(shù)細(xì)胞無：少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（癌細(xì)胞）*3貼壁依賴性細(xì)胞概念：anchoraged-dependentcell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長的細(xì)胞。大多數(shù)動物細(xì)胞都屬於此類。*4非貼壁依賴性細(xì)胞概念：anchoraged-independentcell不依賴於固體支持物表面生長的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，被稱為懸浮細(xì)胞。舉例：血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞。*5兼性貼壁依賴性細(xì)胞概念：對支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。舉例：CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、L929細(xì)胞。理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系。*二動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程1原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)2傳代細(xì)胞培養(yǎng)*1原代細(xì)胞培養(yǎng)－過程*動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾洗滌培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞接種培養(yǎng)從體內(nèi)取出組織或器官經(jīng)過粉碎、消化而獲得單細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng)。37℃消化，胰蛋白酶，膠原酶工作濃度：0.1-0.3mg/ml2傳代細(xì)胞培養(yǎng)－過程概念：對長滿表面的細(xì)胞進(jìn)行消化分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進(jìn)行新一輪培養(yǎng)。傳代時期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞。消化方法：過程與原代細(xì)胞相同。傳代的次數(shù)：不能無限次傳代，保證特性。防止細(xì)胞系之間、非細(xì)胞生物的污染。要領(lǐng)：適宜的時期和方法，不要過度。*三動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1單層貼壁培養(yǎng)2懸浮培養(yǎng)3微載體培養(yǎng)4固定化培養(yǎng)*1單層貼壁培養(yǎng)——概念與過程細(xì)胞貼附於一定的固體支持表面上，形成單層細(xì)胞的培養(yǎng)過程。生長過程：接種，細(xì)胞經(jīng)過吸附、接觸而貼附於基質(zhì)表面；進(jìn)行生長、分裂繁殖，很快進(jìn)入對數(shù)期。數(shù)天就長滿整個表面，形成緻密單層細(xì)胞。*單層貼壁培養(yǎng)——特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時，能達(dá)到高細(xì)胞密度；有利於產(chǎn)物的分泌表達(dá)，可改變培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例。缺點(diǎn)：操作較繁雜，檢測受到限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸。*2懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長的培養(yǎng)過程優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，培養(yǎng)條件相對均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。缺點(diǎn)：細(xì)胞體積小，密度低，培養(yǎng)病毒易失去標(biāo)記而降低免疫能力。適用範(fàn)圍：懸浮細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞，雜交瘤借鑒微生物發(fā)酵理論和經(jīng)驗(yàn)，發(fā)揮動物細(xì)胞的特性*3微載體培養(yǎng)概念：細(xì)胞貼附於微載體上伸展和增殖，再懸浮於培養(yǎng)液中的培養(yǎng)過程。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生長的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重複性好，減少了勞動強(qiáng)度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn)微載體，多孔微載體應(yīng)用：工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原。*4固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學(xué)方法將細(xì)胞固定在載體介質(zhì)上，然後進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。應(yīng)用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞密度高、抗剪切力和污染，生產(chǎn)首選方法共價交聯(lián)：雙功能試劑處理，細(xì)胞之間交聯(lián)。吸附：物理吸附使細(xì)胞貼附在固體載體表面。包埋：細(xì)胞包埋在載體內(nèi)部。微囊法：親水半透膜把細(xì)胞包埋在微囊內(nèi)。*4.4重組人紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)工藝*一概述天然紅細(xì)胞生成素的發(fā)現(xiàn)與種類理化性質(zhì)重組人紅細(xì)胞生成素及其臨床應(yīng)用重組人紅細(xì)胞生成素表達(dá)研究*1天然紅細(xì)胞生成1890：現(xiàn)象，低氧壓下紅細(xì)胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸組成及順序相同，166aa，活性類似。糖基化及其含量不同：EPO-α含有較多的N-乙醯葡糖胺，總含糖量比EPO-β高。*2EPO的理化性質(zhì)大小：166aa糖鏈占分子量的39%。糖基化程度與準(zhǔn)確性對活性影響很大。pI4.2～4.6，對熱和pH變化相對穩(wěn)定。*3重組人紅細(xì)胞生成素第一代：兩種，rhEPO-α和rhEPO-β。1989：Amgen,Epogen；1990,OrthoBiotech,ProcritCHO、BHK細(xì)胞系生產(chǎn)第二代：EPO突變體，2001,Amgen,Arasnep長效。二聯(lián)體或三聯(lián)體EPO：高活性，長效（3－5倍）適應(yīng)癥：腎性貧血、愛滋病患者貧血、癌癥相關(guān)貧血等。隔日注射一次，長效EPO：每週一次。*4rhEPO的表達(dá)研究由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得，人源的紅細(xì)胞生成素。產(chǎn)量極其有限。SV40病毒啟動子驅(qū)動表達(dá)載體，在COS-1中暫態(tài)表達(dá)紅細(xì)胞生成素昆蟲SF9細(xì)胞中桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)rhEPO。產(chǎn)率有所改善，但糖基化程度較小干擾素-α基因啟動子的rhEPO表達(dá)載體，BALL-1細(xì)胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。*大腸桿菌中表達(dá)，僅具有體外抗原結(jié)合活性。家蠶體內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。在CHO、BHK細(xì)胞系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)，獲得的重組紅細(xì)胞生成素與天然紅細(xì)胞生成素相似?，F(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中多採用動物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)紅細(xì)胞生成素進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。*二CHO培養(yǎng)工藝工程CHO細(xì)胞系建立種子細(xì)胞製備反應(yīng)器培養(yǎng)工藝培養(yǎng)過程控制*1工程CHO細(xì)胞系*共轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選培養(yǎng)胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1nMMTX培養(yǎng)基上培養(yǎng)，3－4d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～14天，至性克隆出現(xiàn)。胰酶消化，1：5稀釋，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX濃度逐次升高，篩選抗性克隆。抗性克隆培養(yǎng)於100mm培養(yǎng)皿中，按1：500稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，集落2-4mm。酶聯(lián)免疫分析：確認(rèn)表達(dá)人紅細(xì)胞生成素*2種子細(xì)胞製備凍存的細(xì)胞株37℃水浴，無菌離心。加適量DMEM培養(yǎng)基（10%小牛血清）。37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。細(xì)胞消化後接種，製成接種細(xì)胞濃度。*3灌流培養(yǎng)反應(yīng)器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩衝液，高壓滅菌1.5h。接種：排出PBS緩衝液，加DMEM培養(yǎng)基，接種。貼壁培養(yǎng)：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。擴(kuò)增培養(yǎng)：80－100r/min。灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進(jìn)行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。收穫培養(yǎng)物，4℃－8℃保存。*4培養(yǎng)工藝過程控制攪拌控制：接種後,攪拌速度緩慢，使細(xì)胞貼附於載體上，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。溫度控制：較為嚴(yán)格，恒定37℃pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。溶解氧控制：在50％-80％的範(fàn)圍內(nèi)，通入氧氣、空氣或氮?dú)獾谋壤旌蠚怏w。葡萄糖控制：流加補(bǔ)料代謝廢物控制：監(jiān)測氨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細(xì)胞損害。*三rhEPO的分離純化工藝初級分離精製純化產(chǎn)品品質(zhì)控制*1初級分離收穫培養(yǎng)液：離心過濾：濾膜親和色譜：NaCl－Tris平衡，梯度洗脫，收集活性洗脫峰透析：0.1mMTris，過夜，換液4次。過濾：0.22μm濾膜。*2純化精製DEAE離子交換：NaCl-Tris梯度洗脫，收集活性峰。RP-HPLC：乙腈梯度洗脫，收集活性洗脫峰。凝膠過濾：檸檬酸鹽緩衝液洗脫，收集活性峰過濾：0.22μm濾膜。rhEPO產(chǎn)品：蛋白含量為1.2mg/ml，其比活可為2×105IU/mg。*3EPO的質(zhì)控與活性檢測純度，蛋白質(zhì)含量，分子量等體外活性：ELISA測定（原理免疫沉澱），單位unit（IU）體內(nèi)活性：網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)法，注射BALB/c小鼠，眼眶取血，染色，塗片計數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)。比活性(specificactivity,U/mg)：單位重量蛋白質(zhì)(mg)中所含的活性*

藥物合成工藝研究6.1概述*在設(shè)計和選擇了合理的合成路線後，就需要進(jìn)行生產(chǎn)工藝條件研究。合成路線通?？捎扇舾蓚€合成工序組成，每個合成工序包含若干個化學(xué)單元反應(yīng)。這些化學(xué)單元反應(yīng)往往需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室工藝研究（小試），以便優(yōu)化、選擇最佳的生產(chǎn)條件，也為中試放大作製備。藥物的生產(chǎn)工藝也是各種化學(xué)單元反應(yīng)與化工單元操作的有機(jī)組合與綜合應(yīng)用。*現(xiàn)代有機(jī)合成反應(yīng)特點(diǎn):反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)能在中性、常溫和常壓下進(jìn)行；高選擇性（立體、對映體）；需要少量催化劑（1%1%）；無“三廢”或少“三廢”。*one-potreaction(一勺燴）即多個化學(xué)單元反應(yīng)合併成一個合成工序的生產(chǎn)工藝。也稱一鍋法。後處理：包括產(chǎn)物的分離、精製。它是藥物工藝研究的重要組成部分，只有經(jīng)過後處理才能最終得到符合品質(zhì)規(guī)格的藥物。*探討藥物工藝研究中的實(shí)踐及其有關(guān)理論，需要研究反應(yīng)物分子到生成物分子的變革及其過程，包括：反應(yīng)過程的內(nèi)因（物質(zhì)的性能）反應(yīng)過程的外因（反應(yīng)條件）合成藥物工藝研究需要探索化學(xué)反應(yīng)條件對反應(yīng)物所起作用的規(guī)律性。只有對化學(xué)反應(yīng)當(dāng)內(nèi)因和外因，以及它們之間的相互關(guān)係深入瞭解後，才能正確地將兩者統(tǒng)一起來考慮，才有可能獲得最佳的工藝。*新藥合成工藝研究的七個重大課題配料比參與反應(yīng)當(dāng)各物料相互間物質(zhì)量的比例稱為配料比。通常物料以摩爾為單位，則稱為投料的摩爾比。溶劑化學(xué)反應(yīng)的介質(zhì)、溶劑化作用催化酸堿催化、金屬催化、相