目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及重組子的篩選

關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及重組子的篩選第一節(jié)受體細(xì)胞受體細(xì)胞（receptorcell）：又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞（hostcell），從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。隨著基因工程的發(fā)展，從低等的原核細(xì)胞，到簡(jiǎn)單的真核細(xì)胞，進(jìn)一步到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高等動(dòng)、植物細(xì)胞都可以作為基因工程的受體細(xì)胞。1.受體細(xì)胞的概念第2頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.受體細(xì)胞選擇所應(yīng)遵循的原則便于重組DNA分子導(dǎo)入。能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。（如：限制性內(nèi)切酶缺陷型，避免其對(duì)重組DNA分子的降解破壞作用。）便于重組體的篩選。（選擇與載體所含的選擇標(biāo)記相匹配的受體細(xì)胞基因型）遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)。安全性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染。選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。第3頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無(wú)明顯的偏倚性。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)。在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。第4頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.各種類型受體細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)（1）原核細(xì)胞■優(yōu)點(diǎn)大部分原核細(xì)胞沒(méi)有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入。沒(méi)有核膜，染色體DNA沒(méi)有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。基因組簡(jiǎn)單，不含線粒體和葉綠體基因組，便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。第5頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■缺點(diǎn)由于原核細(xì)胞缺乏真核生物具有的RNA轉(zhuǎn)錄后加工、修飾系統(tǒng)、蛋白質(zhì)翻譯后加工、修飾、折疊復(fù)性系統(tǒng)，使某些真核細(xì)胞中編碼蛋白的基因不能夠在原核細(xì)胞中表達(dá)，甚至即使獲得了表達(dá)，也不具有正常的生物學(xué)活性?！龀Ｓ米魇荏w細(xì)胞的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)藻等。大腸桿菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單。細(xì)胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原反映。目前已實(shí)現(xiàn)商品化的基因工程產(chǎn)品中，大部分是由大腸桿菌工程菌生產(chǎn)的。枯草桿菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單。能將基因第6頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培養(yǎng)。藍(lán)藻：是一種自養(yǎng)生物，培養(yǎng)簡(jiǎn)便易行；可成為植物基因表達(dá)的宿主。（2）真菌細(xì)胞真菌是低等的真核生物，基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都有真核生物的特征，因此可用于表達(dá)真核生物的基因。常用的真菌細(xì)胞有酵母等。（3）植物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：植物細(xì)胞具有全能性，一個(gè)細(xì)胞就能分化成一株完整的植株，這就意味著一個(gè)獲得外源基因的植物細(xì)胞就能培養(yǎng)成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物。第7頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天缺點(diǎn)：具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，外源基因無(wú)法直接導(dǎo)入。方法：（a）經(jīng)纖維素酶處理去掉細(xì)胞壁后獲得原生質(zhì)體。（b）不必去掉細(xì)胞壁，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等。（4）動(dòng)物細(xì)胞■優(yōu)點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞具有RNA的轉(zhuǎn)錄后的剪接、加工機(jī)制，蛋白質(zhì)翻譯后的加工、修飾機(jī)制，蛋白產(chǎn)物的生物學(xué)活性及免疫原性好。易被重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性?？蓪⒈磉_(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于分離、純化?！鋈秉c(diǎn)：不能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后，需采用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第8頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1.重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌■轉(zhuǎn)化（transformation)：重組質(zhì)粒DNA分子通過(guò)與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程稱之為轉(zhuǎn)化?！鲛D(zhuǎn)化的方法制備感受態(tài)細(xì)胞法感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。制備感受態(tài)大腸桿菌一般利用CaCl2處理。第9頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天電穿孔轉(zhuǎn)化法其基本原理是利用電穿孔儀的高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間的通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。轉(zhuǎn)化效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖時(shí)間和外源DNA濃度的影響。三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌原理：是基于可遷移質(zhì)粒的遷移作用（mobilization）而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式。首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。整個(gè)接合轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及到3種有關(guān)的細(xì)菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，故稱三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。第10頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■轉(zhuǎn)化率的計(jì)算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化子數(shù)/DNA分子數(shù)（10-5表示105個(gè)DNA分子獲得一個(gè)轉(zhuǎn)化子）或轉(zhuǎn)化子數(shù)/DNA質(zhì)量（106/μg表示1μgDNA分子得106個(gè)轉(zhuǎn)化子）輔助菌（含有結(jié)合型輔助質(zhì)粒）供體菌（含有目的質(zhì)粒）受體菌含有目的基因的非結(jié)合型重組質(zhì)粒遷移輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移第11頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響轉(zhuǎn)化率的因素a：重組DNA分子的大小、構(gòu)型、濃度、純度及載體與受體細(xì)胞的親和性。b：菌株類型c：轉(zhuǎn)化方法：電穿孔法最高，CaCl2誘導(dǎo)法居中，三親本雜交接合法最低。（2）重組λ嗜菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌■轉(zhuǎn)染（transfection）及轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）轉(zhuǎn)染：將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)λ噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程。第12頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天

采用λ噬菌體DNA直接轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率很低，所以需對(duì)重組的λ噬菌體DNA進(jìn)行體外包裝后，再通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法感染大腸桿菌?！鲶w外包裝體外包裝：在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過(guò)程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。原理：根據(jù)λ噬菌體DNA分子體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包裝蛋白的λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的λ噬菌體突變株。由于兩種突變株均不具有完整的包裝蛋白，都不能單獨(dú)的包裝λ噬菌體DNA。但將兩種突變株分別感染大腸桿菌后，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包裝物（含D蛋白），兩者混合后就能包裝λ噬菌體DNA。第13頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞由于真核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因組成和基因表達(dá)較為復(fù)雜，適用于原核生物的轉(zhuǎn)基因方法大多難以有效的用于真核生物。但近年來(lái)經(jīng)過(guò)摸索，建立了一系列適用于真核生物的轉(zhuǎn)基因方法，并用這些方法有效的獲得了轉(zhuǎn)基因真核生物。（1）重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞■農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌能侵入植物傷口處細(xì)胞中，其所具有的內(nèi)源質(zhì)粒-Ti質(zhì)粒的T-DNA能轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部。因此，將外源基因與Ti質(zhì)粒重組構(gòu)建載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)可將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中。第14頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天Fig.4-16T-DNAcanintegratedintothegenomeofplantcell第15頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■多聚物介導(dǎo)法一些多聚物（聚乙二醇、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）和二價(jià)陽(yáng)離子（Ca2+、Mg2+、Mn2+等）于DNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過(guò)原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。■電穿孔法同原核細(xì)胞的電穿孔法。■激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法利用直徑很小，能量很高的激光微束在細(xì)胞膜上造成可逆性微孔，處于細(xì)胞周圍的DNA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞?！龀暡ń閷?dǎo)轉(zhuǎn)化超聲波處理原生質(zhì)體，使其細(xì)胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。第16頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■基因槍法利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時(shí)能進(jìn)入細(xì)胞，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨之帶入細(xì)胞。第17頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■脂質(zhì)體介導(dǎo)法

脂質(zhì)體（liposome）是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將DNA包在其中，并通過(guò)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過(guò)程，把外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)?！鲲@微注射法

顯微注射法是一種利用顯微操作儀，通過(guò)機(jī)械的方法把外源DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)移方法。早期該技術(shù)主要用于動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化等方面，現(xiàn)在逐步應(yīng)用到植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化操作中，成為一種重要的植物轉(zhuǎn)基因手段?！龌ǚ酃芡ǖ婪ù朔ㄊ菍⑼庠碊NA涂于授粉的枝頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過(guò)珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細(xì)胞壁的卵、合子及早期的胚胎細(xì)胞。第18頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞很難捕獲外源DNA，這明顯影響了哺乳動(dòng)物基因工程的發(fā)展。近年來(lái)通過(guò)探索已建立了幾種能有效地將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法?！霾《绢w粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法■磷酸鈣轉(zhuǎn)染法哺乳動(dòng)物的細(xì)胞能捕獲黏附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。■DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的多聚陽(yáng)離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間的有效表達(dá)。第19頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■聚陽(yáng)離子-DMSO轉(zhuǎn)染法此方法采用聚陽(yáng)離子poly-brene處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，增加細(xì)胞表面對(duì)DNA的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO短暫處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對(duì)DNA的捕獲量?！鲲@微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)■電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)■脂質(zhì)體介導(dǎo)法第20頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天活化菌種，擴(kuò)大培養(yǎng)，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期（OD600=0.4）3-4ml菌液冰水浴中10分鐘，4℃離心集菌菌體懸浮于含CaCl2的預(yù)冷緩沖液中，冰水浴15min，4℃離心集菌，棄上清，沉淀物重懸于CaCl2的預(yù)冷緩沖液中，4℃下放置12-14h0.2ml新制備好的感受細(xì)胞中加入緩沖液溶解的重組DNA，置于冰水浴中1h以上，期間輕搖幾次轉(zhuǎn)入42℃水浴上2min，使感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA。轉(zhuǎn)入37℃水浴上5min，加入1ml不含選擇性藥物的LB培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子37℃震蕩培養(yǎng)30-60min鋪板培養(yǎng)圖6.1感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化第21頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天圖6.2電穿孔儀及電擊杯第22頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天圖6.2λ噬菌體的體外包裝第23頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天圖6.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法第24頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、傳代細(xì)胞準(zhǔn)備：細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24ｈ傳代,待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%滿底時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。2、DNA沉淀液的準(zhǔn)備：首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于5μL無(wú)菌水中，加50μL2.5mol/LCaCl2。3、用巴斯德吸管在500μL

2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時(shí)用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個(gè)過(guò)程需緩慢進(jìn)行，至少需持續(xù)1～2min。4、室溫靜置30min,出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀。5、將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動(dòng)。6、在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞4～16h。除去培養(yǎng)液，用5ml

1×HeBS洗細(xì)胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。7收集細(xì)胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。第25頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)重組子的篩選

在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，并非所有的受體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組DNA分子，一般僅有少數(shù)重組DNA分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。再者，在這些被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中，除部分含有我們期待的DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個(gè)載體與多個(gè)外源DNA片段形成的非期待重組DNA分子導(dǎo)入所致。因此，需要采取必要的方法將重組子從大量的受體細(xì)胞中篩選出來(lái)?！鲛D(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子?！鲋亟M子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子。第27頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■陽(yáng)性克隆子（期望重組子）：含有外源目的基因的重組子稱為陽(yáng)性克隆子或期望重組子?！龊Y選（選擇）：經(jīng)過(guò)各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽(yáng)性克隆子的過(guò)程稱為克隆子的篩選或選擇。1.遺傳表型直接篩選法

在構(gòu)建基因工程載體時(shí)，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特征，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液（包括對(duì)照處理）適量涂布在選擇培養(yǎng)基上，在最適生長(zhǎng)溫度條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察菌落生長(zhǎng)情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子。第28頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■抗藥性篩選氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cmp）、卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet）、鏈霉素（Str）主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選。在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上，含重組質(zhì)粒的受體菌能存活，不含重組質(zhì)粒的受體菌不能存活?！霾迦胧Щ詈Y選法外源DNA的插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因失活，借此篩選重組子?！霾迦氡磉_(dá)篩選法與插入失活策略向相反，插入表達(dá)法是利用外源DNA插入特定載體后導(dǎo)致遺傳標(biāo)記基因表達(dá)，借此篩選重組子。第29頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■顯色互補(bǔ)篩選法

LacZ’基因的藍(lán)白斑篩選■形成嗜菌斑篩選法對(duì)于λDNA載體系統(tǒng)，只有在外源DNA插入載體后，重組的λDNA分子大小在野生型λDNA分子的78%-105%范圍內(nèi)時(shí)，才能在體外包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。后者在轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上被裂解形成嗜菌斑，而非轉(zhuǎn)化子能正常生長(zhǎng)，兩者很容易區(qū)分。2.DNA電泳檢測(cè)法■直接電泳檢測(cè)法重組的質(zhì)粒DNA分子由于有外源DNA的插入，比未插入外源DNA的質(zhì)粒載體大，通過(guò)凝膠電泳就可將重組子篩選出來(lái)。第30頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■酶切電泳篩選法通過(guò)直接電泳檢測(cè)法篩選出來(lái)的重組子，插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通過(guò)將重組子中的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行電泳，就可將陽(yáng)性克隆子篩選出來(lái)?！鯬CR檢測(cè)法外源DNA的兩側(cè)序列多為已知序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增外源DNA，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，就可篩選出陽(yáng)性克隆子。3.核酸分子雜交檢測(cè)法4.免疫化學(xué)檢測(cè)法

基本過(guò)程與核酸分子雜交檢測(cè)法相似，不同的是該法使用抗體探針，而非DNA探針來(lái)鑒定目的基因表達(dá)產(chǎn)物。因而其前提第31頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天條件是克隆基因可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且有目的蛋白的抗體。■放射性抗體檢測(cè)法■免疫沉淀檢測(cè)法■酶聯(lián)免疫檢測(cè)法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）采用非放射性標(biāo)記物（辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等）偶合第二抗體，然后與目的蛋白抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)檢測(cè)非放射性標(biāo)記物從而檢測(cè)到相應(yīng)的蛋白抗原。5.轉(zhuǎn)譯篩選法

轉(zhuǎn)譯篩選法是通過(guò)體外轉(zhuǎn)譯的手段鑒定陽(yáng)性克隆的方法，可分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯和雜交選擇轉(zhuǎn)譯兩種檢測(cè)方法。第32頁(yè),共39頁(yè)，2024年2月25日，星期天■雜交抑制轉(zhuǎn)譯要求：被研究的目的基因編碼有豐富的mRNA。原理：DNA蛋白質(zhì)mRNA蛋白質(zhì)×雜交轉(zhuǎn)化菌落提取重組DNA與總mRNA雜交形成DNA-RNA雜種分子將總mRNA（包