蛋白質(zhì)表征技術(shù)

關(guān)于蛋白質(zhì)表征技術(shù)1蛋白質(zhì)的基本概念

蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。第2頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)不僅在功能上與糖、脂肪不同，在元素組成上亦有差別。

根據(jù)蛋白質(zhì)的元素分析表明，其元素組成依次為：碳(50-55%)、氧（19-24%）、氮（13-19%）、氫（6-7%）硫（0-4%）。有的還含有少量磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘等元素。一切蛋白質(zhì)皆含有氮并且大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量比較接近而恒定，一般為15—17％，平均為16％。這是蛋白質(zhì)元素組成的一個(gè)重要特點(diǎn)，也是各種定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的計(jì)算基礎(chǔ)。即用定氮法測(cè)得的含氮量乘以6．25，即可算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。但有的蛋白質(zhì)中氮的含量有一定差別，應(yīng)根據(jù)其氮的真實(shí)含量進(jìn)行計(jì)算。2蛋白質(zhì)的元素組成第3頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1氨基酸的結(jié)構(gòu)

自然界的氨基酸超過(guò)300種，但是組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，可以看作是羧酸分子中α-碳原子上的氫原子被氨基取代而成的化合物，均屬于α-氨基酸，即其氨基和羧基都連接在α-碳原子上。氨基酸碳鏈表示：其結(jié)構(gòu)可用下列通式表示：注：R代表不同的側(cè)鏈基團(tuán)，R不同代表不同的氨基酸3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位—氨基酸第4頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天各種氨基酸在結(jié)構(gòu)上有下列共同特點(diǎn)：組成蛋白質(zhì)的氨基酸皆為α-氨基酸。

不同的α-氨基酸，其R側(cè)鏈不同（氨基酸分類(lèi)的依據(jù)）。它對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有重要的影響。除R側(cè)鏈為氫原子的甘氨酸外，其它氨基酸的α-碳原子所連接的四個(gè)原子或基團(tuán)互不相同，該碳原子都是不對(duì)稱(chēng)碳原子。20種氨基酸中的脯氨酸含有亞氨基，所以它是亞氨基酸。半胱氨酸在蛋白質(zhì)分子中多數(shù)是以胱氨酸的形式存在。第5頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2氨基酸的分類(lèi)根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)：1）酸性氨基酸——谷氨酸Glu和天冬氨酸Asp

其R基團(tuán)含羧基，在pH7時(shí)，羧基可解離而使分子帶負(fù)電荷。游離或在蛋白質(zhì)中都帶負(fù)電荷，以酸根形式存在。在蛋白質(zhì)中與正電基團(tuán)形成鹽鍵。2）堿性氨基酸——賴(lài)氨酸Lys、精氨酸Arg和組氨酸His其R基團(tuán)含堿性基團(tuán)，在pH7時(shí)，這些基團(tuán)可質(zhì)子化而使分子帶正電荷。3）非極性疏水性氨基酸其R基團(tuán)無(wú)極性、不解離，且為疏水性的。4）不解離的極性氨基酸（極性非電離氨基酸）——羥基氨基酸+巰基氨基酸+甘氨酸其R基團(tuán)雖有極性但不能解離。5）蛋白質(zhì)中少見(jiàn)的氨基酸——無(wú)遺傳密碼，來(lái)自翻譯后加工修飾。第6頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.3氨基酸的理化性質(zhì)3.3.1兩性解離及其等電點(diǎn)氨基酸是兩性電解質(zhì)：氨基酸既含羧基,又含氨基,同時(shí)能起酸和堿的作用，是兩性電解質(zhì)，在水溶液中主要以兼性離子（偶極離子）的形式存在。氨基酸的等電點(diǎn)：在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陰、陽(yáng)離子的趨勢(shì)和程度相等而成為兼性離子，呈電中性時(shí)溶液的pH稱(chēng)為該氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）。

第7頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.3.2紫外吸收性質(zhì)

20種氨基酸在可見(jiàn)光區(qū)無(wú)吸收。在遠(yuǎn)紫外區(qū)：＜220nm都有光吸收。在近紫外光區(qū)（220-300nm）只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收；色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰都在280nm附近。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)中含有色氨酸和酪氨酸殘基，所以可以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的280nm的光吸收值對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。3.3.3茚三酮反應(yīng)

氨基酸與茚三酮水合物共熱生成藍(lán)紫色化合物，在570nm處有最大吸收峰，可以作為定量測(cè)定氨基酸的方法。第8頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.1肽鍵

一個(gè)氨基酸的α-羧基與另一個(gè)氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的共價(jià)鍵（-CO—NH-）稱(chēng)為肽鍵，又稱(chēng)酰胺鍵。蛋白質(zhì)分子中的氨基酸通過(guò)肽鍵連接。4肽第9頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.2肽氨基酸通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的化合物稱(chēng)為肽。第10頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.3氨基酸殘基（residue）氨基酸在形成肽鏈后，因有部分基團(tuán)參加肽鍵的形成，已經(jīng)不是完整的氨基酸，故將蛋白質(zhì)肽鏈中的每個(gè)氨基酸部分稱(chēng)為氨基酸殘基。每一個(gè)氨基酸殘基上都有一個(gè)R側(cè)鏈，不同R側(cè)鏈有不同的性質(zhì)和功能。多肽鏈有兩端：具有游離α-氨基的稱(chēng)為氨基末端（N-末端，aminoterminal），通常寫(xiě)在肽鏈的左端。具有游離α-羧基的稱(chēng)為羧基末端（C-末端，carboxylterminal），常寫(xiě)在肽鏈的右端。多肽鏈的方向從N-端到C-端，肽鏈也是從N-端到C-端按氨基酸殘基的順序來(lái)命名的。第11頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天N端測(cè)序幾乎所有的蛋白合成都起始于N-端，蛋白質(zhì)N-端的序列組成對(duì)于蛋白質(zhì)整體的生物學(xué)功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期，同時(shí)關(guān)聯(lián)著蛋白亞細(xì)胞器定位等，這些與蛋白的功能和穩(wěn)定性息息相關(guān)，對(duì)蛋白進(jìn)行N-端測(cè)序分析，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。方法：目前對(duì)蛋白N端測(cè)序主要分類(lèi)兩大類(lèi)，其一為非質(zhì)譜技術(shù)，例如經(jīng)典的Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對(duì)應(yīng)蛋白的cDNA，再來(lái)反推得到蛋白序列；其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用的長(zhǎng)處和制約之處，目前，市面上采用的，依然是基于經(jīng)典的Edman降解法原理，利用美國(guó)ABI公司Procise491蛋白序列測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行蛋白N-端測(cè)序。原理：Edman化學(xué)降解，其基本原理是包括通過(guò)異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)和多肽的N-端殘基的偶聯(lián)，苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）環(huán)化裂解，和噻唑呤酮苯氨（ATZ）轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）三個(gè)主要的化學(xué)步驟，每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個(gè)氨基酸殘基，同時(shí)暴露出新的游離的氨基酸進(jìn)行下一個(gè)Edman降解，最后通過(guò)轉(zhuǎn)移的PTH-氨基酸鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測(cè)定。第12頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天C端測(cè)序

眾所周知，C端序列是蛋白質(zhì)和多肽的重要結(jié)構(gòu)與功能部位，對(duì)蛋白質(zhì)的生物功能甚至起決定性作用。此外，由于蛋白翻譯后在細(xì)胞內(nèi)需要進(jìn)一步剪切和修飾，通常不能簡(jiǎn)單的使用基因序列對(duì)C-端或N端做簡(jiǎn)單的預(yù)測(cè)，對(duì)于蛋白生物制品來(lái)說(shuō)，使用C-端測(cè)序必不可少，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，蛋白質(zhì)C端測(cè)序?qū)ζ涔δ苎芯繉l(fā)揮越來(lái)越重要的作用。一些新的蛋白質(zhì)C端測(cè)序方法已建立，提高了靈敏度和重復(fù)性，能夠在蛋白質(zhì)組水平應(yīng)用。方法：羧肽酶法、化學(xué)法及串聯(lián)質(zhì)譜法。目前，使用較多的是利用串聯(lián)質(zhì)譜法，其原理為利用蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中有規(guī)律的破碎，獲得蛋白質(zhì)肽段的碎片，分析圖譜得到蛋白質(zhì)的C-端序列。第13頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.1穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用力

蛋白質(zhì)是由許多氨基酸單位通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的，具有特定分子結(jié)構(gòu)的高分子化合物。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可人為劃分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。除一級(jí)結(jié)構(gòu)外，蛋白質(zhì)的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)均屬于空間結(jié)構(gòu)，即構(gòu)象。蛋白質(zhì)的構(gòu)象通常由非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵）來(lái)維系。5蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)第14頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子內(nèi)各個(gè)原子之間相互的立體關(guān)系就是蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)。通常將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。5.2.1蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)：又稱(chēng)為初級(jí)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu),是指蛋白質(zhì)分子中,由肽鍵連接起來(lái)的各種氨基酸的排列順序。每種蛋白質(zhì)都有唯一而確切的氨基酸序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵是肽鍵，有些還包括二硫鍵（-S-S-）。因共價(jià)鍵的鍵能大，故蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)。第15頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目；多肽鏈的氨基酸順序；多肽鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的主要意義：一級(jí)結(jié)構(gòu)是研究高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)；可以從分子水平闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系；可為生物進(jìn)化提供理論依據(jù)；可為人工合成蛋白質(zhì)提供序列參考。

目前可以運(yùn)用氨基酸自動(dòng)分析儀和質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。第16頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天氨基酸序列分析一般采用綜合的方法測(cè)定目標(biāo)制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進(jìn)行比較。自動(dòng)序列分析儀測(cè)序

其原理為Edman降解法，分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個(gè)步驟。首先在pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端第一個(gè)肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色譜法鑒定出降解下來(lái)的PTH-氨基酸種類(lèi)，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。第17頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜所使用的測(cè)序方法是denovo測(cè)序,是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產(chǎn)生的一系列的有規(guī)律的片段離子之間的質(zhì)量差來(lái)推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處的y離子和b離子來(lái)推測(cè)氨基酸序列從而不受翻譯后修飾和純度的限制，但是質(zhì)譜測(cè)序是有局限性的，1.質(zhì)譜測(cè)序依賴(lài)于公共數(shù)據(jù)庫(kù)。如果所研究的物種的基因組沒(méi)有完全被測(cè)序，或者其中部分沒(méi)有對(duì)應(yīng)的序列，那么質(zhì)譜測(cè)序?qū)o(wú)法得出正確的鑒定。2.我們使用的搜索引擎的打分和算法可能也會(huì)使得我們遺漏一部分的肽段和質(zhì)譜圖的匹配，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。3.如果有點(diǎn)突變或者未知修飾存在的話，由于搜庫(kù)算法或者參數(shù)設(shè)置中沒(méi)有考慮到，同樣也無(wú)法得出正確的結(jié)果。質(zhì)譜技術(shù)還廣泛用于蛋白質(zhì)的純度鑒定、分子質(zhì)量測(cè)定、肽(質(zhì))譜分析、二硫鍵、乙?；?、糖基化、磷?；约胺枪矁r(jià)結(jié)合等。第18頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.2.2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)：是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身的折疊方式。形成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的是肽單元或肽鍵平面。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵來(lái)維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件：α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角β-凸起無(wú)規(guī)則卷曲β-折疊β-轉(zhuǎn)角α-螺旋無(wú)規(guī)則卷曲鑒定方法：常用圓二色譜法(Circulardichroism,CD)第19頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天

圓二色譜法

圓二色光譜儀通過(guò)測(cè)量生物大分子的圓二色光譜從而得到生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)平面偏振光通過(guò)具有旋光活性的介質(zhì)時(shí)，由于介質(zhì)中同一種旋光活性分子存在手性不同的兩種構(gòu)型，故它們對(duì)平面偏振光所分解成的右旋和左旋圓偏振光吸收不同，從而產(chǎn)生圓二色性。遠(yuǎn)紫外的圓二色譜可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，近紫外的圓二色譜可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)側(cè)鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用：蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，DNA/RNA反應(yīng)，酶動(dòng)力學(xué)，光學(xué)活性物質(zhì)純度測(cè)量，藥物定量分析。天然有機(jī)化學(xué)與立體有機(jī)化學(xué)，物理化學(xué)，生物化學(xué)與宏觀大分子，金屬絡(luò)合物，聚合物化學(xué)等相關(guān)的科學(xué)研究。第20頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.2.3蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)：是指具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈,按照一定方式再進(jìn)一步卷曲、盤(pán)繞、折疊成一種看來(lái)很不規(guī)則,而實(shí)際上有一定規(guī)律性的三維空間結(jié)構(gòu)。維系三級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要是非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵），如疏水作用、氫鍵、鹽鍵、范氏引力等，但也有共價(jià)鍵，如二硫鍵等。第21頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.2.4蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)：具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子,通過(guò)一些非共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái),而成為具有生物功能的蛋白質(zhì)大分子,就是蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基：是指參與構(gòu)成蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的、每條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。亞基雖然具有二、三級(jí)結(jié)構(gòu),但是在單獨(dú)存在時(shí)并沒(méi)有生物活力,只有完整的四級(jí)結(jié)構(gòu)才具有生物活力。維系蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的是氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水作用等非共價(jià)鍵。血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)第22頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)解析方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)分析主要有三大技術(shù)平臺(tái)（1）X-衍射蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析（2）核磁共振波譜分析（3）冷凍電鏡技術(shù)第23頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)X-衍射分析

摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件、快速處理晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和減少差錯(cuò)是目前蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析的兩大難題或瓶頸。是目前分辨率最高的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，高通量晶體結(jié)構(gòu)分析中的幾大重要環(huán)節(jié)是：數(shù)據(jù)處理與分析、重原子的定位、密度修飾、分子替換、圖形整合、模型加工和確認(rèn)。晶體結(jié)構(gòu)分析的常用軟件有SOLVE，RESOLVE等。第24頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天

核磁共振波譜分析

利用核磁共振原理，檢測(cè)分子質(zhì)量小于60kμ的蛋白質(zhì)，通過(guò)對(duì)其核磁共振譜線特征參數(shù)的測(cè)定來(lái)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，就是將原始資料利用傅里葉變換轉(zhuǎn)換為不同的峰值，然后采集各種不同的峰組成圖譜，并利用生物信息學(xué)方法篩選出具有特定結(jié)構(gòu)特征的圖譜。常用NMRPipe和SPARKY軟件處理這些過(guò)程，使用XEASY，DYANA和GARANT等軟件分析側(cè)鏈或骨架結(jié)構(gòu)。第25頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天冷凍電子顯微鏡技術(shù)

采用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態(tài)的水環(huán)境中，使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)；同時(shí)冷凍的速度極快，把細(xì)胞在其生理活動(dòng)的某些特定時(shí)刻固定下來(lái)，顯示此時(shí)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，進(jìn)而可通過(guò)不同功能狀態(tài)的瞬時(shí)構(gòu)象變化來(lái)研究生物分子的功能。冷凍電鏡獲得的是處于天然狀態(tài)下未經(jīng)染色的分子的二維投影像。將樣品進(jìn)行不同角度的傾斜所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，并依據(jù)樣品的不同特性使用不同的重構(gòu)技術(shù)獲得分子的結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上觀察多種成分的圖像變化，追蹤生物大分子的裝配及其動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

第26頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可視化

可視化分析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，有利于從原子間相互作用的層次理解生命活動(dòng)過(guò)程的信息控制機(jī)制，更加有效地揭示分子在完成其功能過(guò)程中的演化情況，了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和各種微觀性質(zhì)與宏觀性質(zhì)之間的定量關(guān)系。只要安裝蛋白質(zhì)分子圖形學(xué)軟件，并獲得所需蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，配以商業(yè)軟件或免費(fèi)的小分子圖形設(shè)計(jì)系統(tǒng)，就可開(kāi)展結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的探索性工作。第27頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.1兩性和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)是由α-氨基酸通過(guò)肽鍵構(gòu)成的高分子化合物，在蛋白質(zhì)分子中存在著氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)。等電點(diǎn)（isoe1ectricpoint，pI）：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于某一pH值的溶液中時(shí)，蛋白質(zhì)分子上所帶的正、負(fù)電荷相等，凈電荷為零，蛋白質(zhì)為兼性離子，此時(shí)溶液的pH值稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoe1ectricpoint，pI）。等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)的特征常數(shù)，各種蛋白質(zhì)有各自的等電點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境的pH大于pI（等電點(diǎn)）時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，pH小于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，pH等于pI時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，此時(shí)溶解度最小。等電點(diǎn)檢測(cè)方法：毛細(xì)管電泳法，等點(diǎn)聚焦電泳6蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第28頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.2水解反應(yīng)

蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，經(jīng)過(guò)多肽，最后得到多種α-氨基酸。蛋白質(zhì)水解時(shí)，應(yīng)找準(zhǔn)結(jié)構(gòu)中鍵的“斷裂點(diǎn)”，水解時(shí)肽鍵部分或全部斷裂。舉例：Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，但該法一次只能降解幾十個(gè)氨基酸殘基，因此利用蛋白質(zhì)的水解性質(zhì)將蛋白質(zhì)水解為一些小肽段，分別進(jìn)行測(cè)序，最后進(jìn)行拼接，獲得蛋白質(zhì)的氨基酸順序。6.3膠體性質(zhì)

有些蛋白質(zhì)能夠溶解在水里（例如雞蛋白能溶解在水里）形成溶液。蛋白質(zhì)的分子直徑（1-100nm）達(dá)到了膠體微粒的大小，所以蛋白質(zhì)具有膠體的性質(zhì)。在蛋白質(zhì)表面有親水基團(tuán)，能與水發(fā)生水合作用，水分子受蛋白質(zhì)極性基團(tuán)的影響，定向排列在蛋白質(zhì)分子的周?chē)?，形成水化層，將蛋白質(zhì)顆粒分開(kāi)，不致相聚而沉淀。蛋白質(zhì)在偏離等電點(diǎn)的溶液中，形成電荷層，同性電荷相斥，防止蛋白質(zhì)顆粒相聚沉淀。第29頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.4沉淀

原因：加入高濃度的中性鹽、加入有機(jī)溶劑、加入重金屬、加入生物堿或酸類(lèi)、熱變性。鹽析：向蛋白質(zhì)水溶液中加入濃的無(wú)機(jī)鹽溶液，可使蛋白質(zhì)的溶解度降低，而從溶液中析出，這種作用叫做鹽析。鹽析出的蛋白質(zhì)仍舊可以溶解在水中，而不影響原來(lái)蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因此鹽析是個(gè)可逆過(guò)程。利用這個(gè)性質(zhì)，采用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質(zhì)．

不同的蛋白質(zhì)其性質(zhì)不同，耐受酸、堿、鹽、重金屬等的程度也不同，因此我們?cè)賹?duì)純化工藝獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)充分了解該蛋白質(zhì)的相關(guān)性質(zhì)及緩沖成分，保證檢測(cè)任務(wù)順利進(jìn)行。第30頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.5變性

蛋白質(zhì)的變性：是指蛋白質(zhì)在某些理化因素影響下，其特定空間結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性喪失的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)變性的物理因素有：高溫、高壓、超聲波、紫外線、X射線等。蛋白質(zhì)變性的化學(xué)因素有：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、濃乙醇、重金屬、尿素、去污劑等。蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)：蛋白質(zhì)變性只破壞二硫鍵和次級(jí)鍵，而不涉及肽鍵的斷裂，因此一級(jí)結(jié)構(gòu)并未破壞。蛋白質(zhì)變性后性質(zhì)的改變：溶解度降低、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。Gly-SDS:還原性-SDS：還原劑為DTT或巰基乙醇，樣品需煮沸，高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，一級(jí)結(jié)構(gòu)未被破壞。非還原性SDS(不含還原劑，但含有SDS)，樣品不需煮沸，檢測(cè)蛋白質(zhì)是否存在二硫鍵或多聚體，也可簡(jiǎn)單判斷蛋白質(zhì)是否復(fù)性成功。Native：是在不加入SDS、巰基乙醇等變性劑的條件下，對(duì)保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳。在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子的生物活性和構(gòu)像。為什么蛋白質(zhì)純度檢測(cè)用非還原性電泳？第31頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用：如在臨床上用高溫、高壓、紫外線、75%酒精消毒就是利用了這些變性因素使細(xì)菌、病毒的蛋白質(zhì)變性，從而失去致病作用。在蛋白質(zhì)的制備過(guò)程中，如果提取的目的蛋白是熱穩(wěn)定的，可利用熱變形的方法很方便的除去其它雜蛋白。而對(duì)于不利的變性則應(yīng)該盡量避免。第32頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的復(fù)性：是指有些蛋白質(zhì)變性后，如果設(shè)法將變性因素除去，該變性蛋白質(zhì)尚能恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)與活性。利用蛋白質(zhì)的復(fù)性特征可對(duì)包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行變性-復(fù)性純化。例如在包涵體蛋白質(zhì)純化過(guò)程中常用尿素或鹽酸胍對(duì)包涵體進(jìn)行溶解，純化獲得目的蛋白后，再通過(guò)透析除去變性劑(尿素、鹽酸胍、β-巰基乙醇等)，或通過(guò)稀釋減少變性劑的含量，則其特定的氨基酸順序重新卷曲、折疊成原來(lái)的天然構(gòu)象，酶的活性也恢復(fù)到原來(lái)的水平。檢測(cè)復(fù)性成功的方法：非還原性電泳、生物活性檢測(cè)、結(jié)構(gòu)確認(rèn)第33頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.6呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中，肽鍵及某些氨基酸殘基的化學(xué)基團(tuán)，可與某些化學(xué)試劑反應(yīng)顯色，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)。利用這些呈色反應(yīng)可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。6.7蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)

這要來(lái)自酪氨酸和色氨酸對(duì)于280nm紫外光的吸收，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。第34頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個(gè)最基本技術(shù)，是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問(wèn)題，尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時(shí)顯得更重要。研究一個(gè)新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進(jìn)行分離純化，最終用純品對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。如果對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來(lái)將會(huì)困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)首先要對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進(jìn)行分析鑒定。蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子,能代表其特征參數(shù)很多。但在普通實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行測(cè)定的、最常用的參數(shù)，歸納起來(lái)主要有以下幾種：蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定(分子量)蛋白質(zhì)帶電性鑒定(等電點(diǎn))蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定(一二級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、N和C-末端)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定(生物活性、比活、酶促動(dòng)力學(xué))免疫學(xué)鑒定(抗原-抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng))7蛋白質(zhì)的表征第35頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天7.1蛋白質(zhì)的純化

蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)和起點(diǎn)。蛋白質(zhì)的來(lái)源是多樣的，主要來(lái)自動(dòng)物、植物的各種組織和微生物，取材要采用含量豐富的器官。抽提蛋白質(zhì)的第一步是將組織粉碎，破壞細(xì)胞，以便于抽提出蛋白質(zhì)；第二步就是對(duì)抽提出來(lái)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。7.1.1幾種常見(jiàn)的細(xì)胞破碎方法

(1)機(jī)械方法

1)搗碎發(fā)；2)研磨法；3)勻漿法

(2)物理方法

1)溫差法；2)壓差法

(3)生物化學(xué)方法

1)采用化學(xué)試劑甲苯、丙酮、氯仿、Triton等通過(guò)化學(xué)滲透使細(xì)胞內(nèi)含物選擇性的滲透出來(lái)；2)自溶法；3)酶解法第36頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天7.1.2蛋白質(zhì)的純化方法7.1.2.1將多組分蛋白質(zhì)變?yōu)閱我唤M分蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)的分子形狀和分子質(zhì)量大小、電離性質(zhì)、溶解度和疏水性、生物功能專(zhuān)一性等，常用有各種鹽析法、超離心沉降、結(jié)晶、電泳、凝膠過(guò)濾，離子交換層析、親和層析、疏水層析等。近年來(lái)發(fā)展的FPLC和HPLC大大促進(jìn)了許多蛋白質(zhì)在毫克級(jí)的純化，其量足夠用于蛋白質(zhì)的化