ITC等溫滴定量熱法的操作說明

等溫滴定量熱法

(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)2011-10-13IsothermalTitrationCalorimetry,ITC等溫滴定量熱技術(shù)（ITC）是一種監(jiān)測由結(jié)合成分的添加而起始的任何化學(xué)反應(yīng)的熱力學(xué)技術(shù)，即用一種反應(yīng)物滴定另一種反應(yīng)物，隨著加入滴定劑的數(shù)量的變化，測量反應(yīng)體系溫度的變化它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息，它已經(jīng)成為鑒定生物分子間相互作用的首選方法?？色@得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點數(shù)（n）、摩爾結(jié)合焓（△H）、摩爾結(jié)合熵（△S）、摩爾恒壓熱容（△Cp），和動力學(xué)參數(shù)(如酶促反應(yīng)的Km和kcat）2021/10/10星期日2ppt精選獨特特點：它對被研究體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件，即具有非特異性的獨特優(yōu)勢，樣品用量小，方法靈敏度和精確度高(儀器最小可檢測熱功率2nW，最小可檢測熱效應(yīng)0.125uJ，生物樣品最小用量0.4ug，溫度范圍2℃-80℃，滴定池體積(1.43ml)。實驗時間較短(典型的ITC實驗只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應(yīng)時間)，操作簡單(整個實驗由計算機(jī)控制，使用者只需輸入實驗的參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量等，計算機(jī)就可以完成整個實驗，再由Origin軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù))。測量時不需要制成透明清澈的溶液,而且量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)行后續(xù)生化分析。盡管微量熱法缺乏特異性但由于生物體系本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于發(fā)現(xiàn)新現(xiàn)象和新規(guī)律，特別適應(yīng)于研究生物體系中的各種特異過程。2021/10/10星期日3ppt精選Applicationsinclude:CharacterizationofmolecularinteractionsofsmallmoleculesLeadoptimization.Enzymekinetics.Assessmentoftheeffectofmolecularstructurechangesonbindingmechanisms.Assessmentofbiologicalactivity.2021/10/10星期日4ppt精選2021/10/10星期日5ppt精選在恒溫下，注射器中的“配體”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。當(dāng)配體注射到池中，兩種物質(zhì)相互作用，釋放或吸收的熱量與結(jié)合量成正比。當(dāng)池中的高分子被配體飽和時，熱量信號減弱，直到只觀察到稀釋的背景熱量。2021/10/10星期日6ppt精選ITC系統(tǒng)是通過細(xì)胞反饋網(wǎng)絡(luò)CFB來分別測量或者補(bǔ)償樣品和對照由于反應(yīng)所產(chǎn)生或者吸收的熱量。兩個硬幣狀的東西放置在絕熱的圓筒中，通過那個細(xì)細(xì)的管子與外界聯(lián)通。有兩個熱量檢測裝置。一個用來檢測兩個樣品之間的熱量差，另一個檢測對照和環(huán)境的熱量差。當(dāng)樣品中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的時候，釋放或者吸收熱量，因此樣品和對照的溫度差會通過對樣品進(jìn)行增加或者減少熱量而穩(wěn)定在一個水平，就是baseline。因此那些用來維持ΔT1=常數(shù)的熱量就被系統(tǒng)檢測畫作曲線。2021/10/10星期日7ppt精選2021/10/10星期日8ppt精選滴定一般在盡可能接近絕熱的條件下進(jìn)行，被滴定物可以是液體或懸浮的固體；滴定劑可以是液體或氣體。溫度變化是由滴定劑與被滴定物間的化學(xué)作用或物理作用（例如一種有機(jī)分子吸附于固體表面）引起的。實驗數(shù)據(jù)以熱譜圖形式表示，它提供了有關(guān)反應(yīng)中物質(zhì)的量（滴定終點）和反應(yīng)物質(zhì)的特性（焓變）的數(shù)據(jù)。對圖進(jìn)行分析，可以得知反應(yīng)容器中發(fā)生的反應(yīng)的類型和數(shù)目，以及溶液中存在的各物種的濃度等信息。這部分內(nèi)容稱為熱滴定，同時還可以確定反應(yīng)的化學(xué)計量關(guān)系，計算反應(yīng)的熱力學(xué)量,如平衡常數(shù)K(ΔG°)、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的焓變ΔH°和熵變ΔS°,這部分內(nèi)容稱為滴定量熱法。測溫滴定法以熱效應(yīng)為基礎(chǔ),與溶液的許多性質(zhì)(如粘度、光學(xué)透明度、介電常數(shù)、溶劑強(qiáng)度、以及離子強(qiáng)度等)無關(guān),因此可以用于氣相、液相、非水溶液、有色溶液、膠體溶液和粘稠漿狀等體系。2021/10/10星期日9ppt精選典型的ITC數(shù)據(jù)配體溶液20次注射到ITC池的蛋白溶液中。每個注射峰（上圖）下方的區(qū)域與注射所釋放的總熱量相等。當(dāng)這種綜合的熱量相對添加到池中的配體摩爾比作圖時，就獲得了相互作用的完整結(jié)合等溫線（下圖）。用單位點模型來驗證數(shù)據(jù)?；瘜W(xué)計量、結(jié)合常數(shù)及焓的數(shù)值都顯示在框內(nèi)。2021/10/10星期日10ppt精選2021/10/10星期日11ppt精選ITC法測量結(jié)合/解離常數(shù)ITC可以直接測量焓變△H，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對反應(yīng)體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團(tuán)，因此測得的結(jié)果更加可信2021/10/10星期日12ppt精選2021/10/10星期日13ppt精選2021/10/10星期日14ppt精選（△G）與總的結(jié)合親和力直接相關(guān)，但不能了解結(jié)合機(jī)理。ITC提供了（△G）以及（△H）和（△S），產(chǎn)生了結(jié)合機(jī)理的真實圖像。作用機(jī)理研究與分析開發(fā)2021/10/10星期日15ppt精選ITC：用生物相關(guān)模型系統(tǒng)架起橋梁ITC的關(guān)鍵優(yōu)勢之一是創(chuàng)建生物相關(guān)實驗的獨特能力。再沒有其他技術(shù)能提供完全無標(biāo)記且液相的分析環(huán)境，同時無需靶點高分子或配體的固定。ITC的應(yīng)用在相關(guān)模型生物系統(tǒng)的建立和驗證中起了重要的作用。2021/10/10星期日16ppt精選INSTHANKYOU!此課件下