生物化學(xué)-王鏡巖版-上省公開課一等獎全國示范課微課金獎?wù)n件

第七章蛋白質(zhì)分離、純化與表征分離純化之前確保蛋白質(zhì)一定純度依據(jù)：大小、形狀、溶解度、酸堿性、吸附性及對配體親和性若要研究蛋白質(zhì)功效則要求高級結(jié)構(gòu)完整第1頁1、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)：酸堿性質(zhì)、膠體性質(zhì)與沉淀、顏色反應(yīng)、變性2、分離純化方法：鹽析、電泳、等電聚焦、層析等第2頁蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)溶解度最小，在電場中不移動。在不一樣pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)電學(xué)性質(zhì)不一樣。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負電荷，在電場中向正極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳1、酸堿性質(zhì)第3頁PCOOHNH3+PCOO-NH3+PCOO-NH2陽離子PH<PI陰離子PH>PI兼性離子PH=PIH+OH-H+OH-可解離基團有末端和側(cè)鏈故pI與酸性、堿性氨基酸數(shù)目相關(guān)如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等電點偏酸性有些球蛋白可解離基團只有變性后才能完全滴定沒有鹽類干擾時等電點叫等離子點第4頁蛋白質(zhì)分子顆粒直徑已達1-100nm，處于膠體顆粒范圍。所以，蛋白質(zhì)含有親水溶膠性質(zhì)。因為膠體溶液中蛋白質(zhì)不能經(jīng)過半透膜，所以能夠應(yīng)用透析法將非蛋白小分子雜質(zhì)除去。2、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)：第5頁蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)布郎運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，含有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定原因：1）表面形成水膜（水化層）2）帶相同電荷。第6頁蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性與它分子量大小、所帶電荷和水化作用相關(guān)。改變?nèi)芤簵l件，將影響蛋白質(zhì)溶解性質(zhì)在適當(dāng)條件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。蛋白質(zhì)沉淀作用第7頁加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出。分段鹽析：調(diào)整鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中幾個蛋白質(zhì)分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。2.加有機溶劑加重金屬鹽加生物堿試劑單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。第8頁在溫和條件下，經(jīng)過改變?nèi)芤簆H或電荷情況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生改變，在適當(dāng)條件下，能夠重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等?？赡娉恋淼?頁在強烈沉淀條件下，不但破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。因為沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)改變，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。不可逆沉淀第10頁一、蛋白質(zhì)在一些理化原因作用下，其空間結(jié)構(gòu)受到破壞，從而改變其理化性質(zhì)，并失去其生物活性，稱為蛋白質(zhì)變性。二、變性實質(zhì)是破壞了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，并不引發(fā)一級結(jié)構(gòu)改變。變性恢復(fù)3、蛋白質(zhì)變性第11頁蛋白質(zhì)性質(zhì)與它們結(jié)構(gòu)親密相關(guān)。一些物理或化學(xué)原因，能夠破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引發(fā)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并造成其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性(denaturation)。第12頁在一些物理或化學(xué)原因作用下，蛋白質(zhì)嚴格空間結(jié)構(gòu)被破壞（不包含肽鍵斷裂），從而引發(fā)蛋白質(zhì)若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)改變第13頁蛋白質(zhì)變性變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所含有性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)變性通常都伴伴隨不可逆沉淀。引發(fā)變性主要原因是熱、紫外光、激烈攪拌以及強酸和強堿等。第14頁變性蛋白質(zhì)主要標(biāo)志是生物學(xué)功效喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結(jié)晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈渙散，反應(yīng)基團增加，易被酶消化。變性蛋白質(zhì)分子相互凝集為固體現(xiàn)象稱凝固。有些蛋白質(zhì)變性作用是可逆，其變性如不超出一定程度，經(jīng)適當(dāng)處理后，可重新變?yōu)樘烊坏鞍踪|(zhì)。第15頁引發(fā)蛋白質(zhì)變性原因有：①物理原因：高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等；②化學(xué)原因：強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽等。第16頁變性蛋白質(zhì)性質(zhì)改變：①物理性質(zhì)：旋光性改變，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化學(xué)性質(zhì)：官能團反應(yīng)性增加，易被蛋白酶水解。③生物學(xué)性質(zhì)：原有生物學(xué)活性喪失，抗原性改變。第17頁蛋白質(zhì)變性可逆性：蛋白質(zhì)在體外變性后，絕大多數(shù)情況下是不能復(fù)性；如變性程度淺，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象未被嚴重破壞；或者蛋白質(zhì)含有特殊分子結(jié)構(gòu)，并經(jīng)特殊處理則能夠復(fù)性。第18頁核糖核酸酶變性與復(fù)性第19頁蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出現(xiàn)象稱為沉淀。變性后蛋白質(zhì)因為疏水基團暴露而易于沉淀，但沉淀蛋白質(zhì)不一定都是變性后蛋白質(zhì)。加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱為凝固。所以，凡凝固蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。第20頁反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)相關(guān)基團有此反應(yīng)蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵全部蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)AgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反應(yīng))乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng))α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)(Folin-Cioculteu反應(yīng))堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍色自由氨基及羧基α-氨基酸

4、蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)—OHN第21頁大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收。所以，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強吸收。利用這個性質(zhì)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行定性判定。5、蛋白質(zhì)紫外吸收第22頁蛋白質(zhì)分離與純化方法（一）鹽析與有機溶劑沉淀：鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析。第23頁慣用中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時，溶液pH在蛋白質(zhì)等電點處效果最好。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時，通常不會引發(fā)蛋白質(zhì)變性。第24頁分段鹽析：

半飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿球蛋白，而飽和硫酸銨溶液可沉淀血漿清蛋白。

第25頁2.有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)：凡能與水以任意百分比混合有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白質(zhì)。沉淀原理是：①脫水作用；②使水介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。第26頁（二）電泳：帶電粒子在電場中移動現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis)蛋白質(zhì)分子在溶液中可帶凈負電荷或帶凈正電荷，故可在電場中發(fā)生移動。不一樣蛋白質(zhì)分子所帶電荷量不一樣，且分子大小也不一樣，故在電場中移動速度也不一樣，據(jù)此可相互分離。第27頁電泳蛋白質(zhì)在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)電泳現(xiàn)象，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)進行分離純化。第28頁自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進行電泳。2.區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液支持物上進行電泳，不一樣組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。第29頁1）圓盤電泳：玻璃管中進行凝膠電泳。+—2）平板電泳：鋪有凝膠玻板上進行電泳。-+兩種凝膠電泳第30頁等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－第31頁SDSPAGE中SDS作用：陰離子去污劑，變性，蛋白質(zhì)伸展態(tài)屏蔽蛋白質(zhì)電荷，都帶負電荷使得蛋白質(zhì)形狀趨于一致所以在這種特殊電泳中，遷移率與蛋白質(zhì)電荷無關(guān)，與蛋白質(zhì)形狀無關(guān)，取決于蛋白質(zhì)大?。ǚ肿恿浚┑?2頁（三）層析：層析（chromatography)是一個利用混合物中各組分理化性質(zhì)差異，在相互接觸兩相（固定相與流動相）之間分布不一樣而進行分離分析技術(shù)方法。主要層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等。第33頁凝膠過濾分離蛋白質(zhì)第34頁（四）超速離心：利用物質(zhì)密度不一樣，經(jīng)超速離心后，分布于不一樣液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)分子量，蛋白質(zhì)分子量與其沉降系數(shù)S成正比。第35頁蛋白質(zhì)相對分子量在10000-1000000之間。測定分子量主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準(zhǔn)確可靠方法是超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計）：蛋白質(zhì)顆粒在25-50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里沉降速度。

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）x=蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心距離（cm）沉降系數(shù)單位慣用S，1S=1×10