生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座

第五章

動植物細胞培養(yǎng)動力學

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第1頁5．1動植物細胞培養(yǎng)特征動植物細胞培養(yǎng)技術是一項將動植物組織、器官或細胞在適當培養(yǎng)基中進行離體培養(yǎng)技術。組織是指由結構和功效相同細胞和細胞間質(zhì)組成，含有一定形態(tài)和生理功效聚集體。器官是指機體中含有特殊結構和完成特殊功效分化部分。組織與器官培養(yǎng)是指在人工條件下，使它們得以繼續(xù)生存或發(fā)展一個培養(yǎng)方法。依據(jù)培養(yǎng)對象不一樣，細胞培養(yǎng)分為動物細胞培養(yǎng)與植物細胞培養(yǎng)兩類，下面介紹這兩類細胞培養(yǎng)基本特征。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第2頁5．1．1動物細胞培養(yǎng)特征因為動物細胞體外培養(yǎng)含有顯著表示產(chǎn)物優(yōu)點，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，所以，生物技術中許多有價值生物制品，需要借助于動物細胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進了動物細胞培養(yǎng)技術發(fā)展。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第3頁早在19，美國Harrison在世界上首次將蛙神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動物組織體外培養(yǎng)第一塊基石。1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關于在培養(yǎng)細胞中生長病毒匯報，開拓了以動物病毒為研究對象新領域。當初人們已知道在細胞培養(yǎng)物中存在一些有特殊功效蛋白質(zhì)，如干擾素、抗生素、疫苗等，不過因為動物細胞營養(yǎng)要求復雜，培養(yǎng)要求嚴格，長久以來未能利用細胞培養(yǎng)來進行有經(jīng)濟價值物質(zhì)生產(chǎn)。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第4頁作為大規(guī)模細胞培養(yǎng)，Copsik等成功地進行了相關倉鼠腎細胞(BHK)懸浮培養(yǎng)。隨即，細胞培養(yǎng)原理與方法日臻完善。采取在培養(yǎng)液中添加人工合成小球狀惰性聚合體載體，大幅度提升了細胞產(chǎn)量，并在10000L發(fā)酵罐內(nèi)成功地進行深層培養(yǎng)。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第5頁伴隨基因工程技術發(fā)展，人們逐步認識到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細胞內(nèi)表示，它們需要經(jīng)過真核細胞所特有翻譯后修飾，以及正確切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣功效和抗原性，使得動物細胞一躍成為一個主要宿主細胞，用以生成各種生物制品，如病毒疫苗、淋巴因子(如r干擾素等)、單克隆體、紅細胞生成素、纖維蛋白溶酶原激活劑、第八因子、腫瘤壞死因子、上皮生長因子和過氧化物歧化酶等。采取大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)珍貴藥品在臨床診療、治療和預防等方面都有主要意義。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第6頁動物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)對比有許多不一樣點(表5—1)。主要是動物細胞無細胞壁，機械強度低，適應環(huán)境能力差；生長速度遲緩，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素，且大多數(shù)哺乳動物細胞需附著在固體或半固體表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴格；大規(guī)模培養(yǎng)時，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)經(jīng)驗等。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第7頁生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第8頁大規(guī)模細胞培養(yǎng)主要危險之一是微生物污染。設備、培養(yǎng)基、懸浮系統(tǒng)和操作方法等復雜性都易引發(fā)微生物污染，這是細胞培養(yǎng)都存在一個普遍問題，在大規(guī)模培養(yǎng)中更為嚴重。動物細胞生長十分遲緩，并易被大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體(mycoplasma)對動物細胞培養(yǎng)威脅最大，因為其感染力強且不易檢出。所以，大規(guī)模細胞培養(yǎng)成功必要條件是要有一個設備精良細胞庫(cellbank)。在細胞庫中冷凍細胞不受污染。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第9頁因為動物細胞無細胞壁，所以人們普通認為細胞脆性是造成培養(yǎng)控制(如溶氧)復雜化關鍵。然而，選擇堅韌細胞，就不存在上述問題。經(jīng)仔細設計培養(yǎng)裝置可使細胞懸浮液很好混合，在向培養(yǎng)基內(nèi)流加基質(zhì)和輸送氣體時也不會損壞細胞。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第10頁動物細胞培養(yǎng)基配方十分復雜，而且還需補充血清和蛋白胨。原料質(zhì)量控制和培養(yǎng)基生產(chǎn)是大規(guī)模細胞培養(yǎng)主要問題。因為血清起源困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來困難等，所以，常采取無血清培養(yǎng)基。不過，在無血清培養(yǎng)基中更可能出現(xiàn)細胞毒(與水中微量元素或有機污染相關)。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第11頁所以，與培養(yǎng)物相接觸水必須采取高純度水。高純度水腐蝕性很強，而且有從金屬物瀝出元素能力，所以，凡是與純水接觸不銹鋼容器和管道表面都必須進行適當處理。培養(yǎng)基普通需經(jīng)膜過濾器過濾。慣用膜過濾器可確保其無菌狀態(tài)，甚至支原體也可被0．1um過濾膜濾出。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第12頁當前，利用動物細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)有用產(chǎn)品大致可分為4大類：①疫苗；②干擾素；③單克隆抗體；④遺傳重組產(chǎn)品。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第13頁總之，動物細胞培養(yǎng)過程特征是：(1)生長速率慢，易被微生物污染，但可采取在培養(yǎng)基中加入抗生素等辦法來處理。(2)細胞個體大且無壁，對環(huán)境敏感，所以應慎重處理供氧(攪拌與通風)與細胞脆弱矛盾。(3)設備放大是一新課題，不能完全按照微生物反應過程經(jīng)驗。(4)反應過程成本高，主要用于高附加值產(chǎn)物生產(chǎn)。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第14頁生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第15頁5．1.2植物細胞培養(yǎng)特征

相關植物細胞培養(yǎng)基礎研究很多，而工業(yè)規(guī)模應用卻較少。早在19，出生于奧地利德國植物學家巳Haberlandt就預言植物細胞培養(yǎng)可能性。1937年前后，法國和美國科學家分別成功地進行了胡蘿卜和煙草組織培養(yǎng)。隨即，人們認識到生長素等植物激素在組織培養(yǎng)中作用。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第16頁1966年Klein指出，能利用植物細胞培養(yǎng)物代替栽培植株來生產(chǎn)生化制品。近40年來，植物細胞培養(yǎng)研究成功例子已經(jīng)有不少，如用紫草懸浮培養(yǎng)物生產(chǎn)紫草寧，煙草細胞大量培養(yǎng)等。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第17頁與微生物相比，植物細胞含有這么一些特征(表4—1)：①細胞個大，而且細胞壁是以纖維素為主要成份，耐拉不耐扭，所以，抗剪切能力低。②與動物細胞培養(yǎng)類同，生長速率慢，為預防培養(yǎng)過程中染菌，需加抗生素。③細胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液黏度大，且不能強力通風攪拌。④產(chǎn)物在細胞內(nèi)且產(chǎn)量低。⑤培養(yǎng)植物細胞常生長成各種大小團塊(從幾個細胞到幾百個細胞)，增加了懸浮培養(yǎng)難度等。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第18頁生長遲緩等是植物細胞先天不足，然而它能產(chǎn)生一些微生物所不能合成特有代謝產(chǎn)物，如朝鮮參皂角苷、桉樹油和一些生物堿等。植物細胞培養(yǎng)技術為大規(guī)模生產(chǎn)這些有用物質(zhì)提供了新路徑。細胞培養(yǎng)用于試管苗生產(chǎn)，如蘭花等名貴花卉培育，能夠不受環(huán)境影響。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第19頁利用植物細胞培養(yǎng)技術進行工業(yè)化生產(chǎn)，有產(chǎn)品規(guī)格好；易到達供需平衡；生產(chǎn)占地少等優(yōu)點。進入20世紀90年代以來，伴伴隨紫杉醇研究成功并應用于臨床，植物細胞培養(yǎng)及其次級代謝產(chǎn)物研究進入了新發(fā)展時期，尤其是誘導子、前體飼喂、兩相法培養(yǎng)、質(zhì)體轉化、毛狀根和冠癭瘤組織培養(yǎng)等新技術和新方法發(fā)覺和發(fā)展，更顯示了植物細胞培養(yǎng)工程在制藥領域遼闊發(fā)展前景。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第20頁另外，將固定化技術應用于植物細胞培養(yǎng)中研究對有效改進植物細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)不足有一定成效。能夠認為，固定化技術有可能在植物細胞培養(yǎng)中得以應用。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第21頁5．2生長模型與培養(yǎng)條件

5．2．1動植物細胞生長模型微生物生長是各種環(huán)境因子與細胞內(nèi)復雜代謝反應綜合結果，生長與環(huán)境因子關系當前還難以用簡單方程式來表示。同理，動植物細胞生長是細胞與影響細胞生長環(huán)境因子相互作用綜合結果，而且其研究還處于萌芽階段。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第22頁5．2．1．1碳源與生長模型

微生物反應中，細胞生長速率與限制性基質(zhì)間關系慣用Monod方程來描述。同理，Monod方程也能夠用于表示一些碳源與動植物細胞生長速率間關系。比如，在植物細胞培養(yǎng)過程中，多以蔗糖為碳源，據(jù)安田報道，煙草細胞在分批培養(yǎng)中，細胞生長速率與蔗糖濃度關系可利用Monod方程來表示，此時umax＝0．023h-1，Ks＝2．35g/L。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第23頁蔗糖為碳源時，植物細胞首先分解蔗糖為葡萄糖和果糖，然后優(yōu)先利用葡萄糖。分別以果糖或葡萄糖為碳源分批培養(yǎng)煙草細胞時，前者有umax＝0．038h-1，Ks=0．25g／L，后者為umax=0．038h-1，Ks＝0．94g／L。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第24頁5．2．1．2呼吸與生長模型

因為動植物細胞培養(yǎng)過程是好氧過程，所以，許多科技工作者研究了與細胞呼吸速率相關原因。比如，人參細胞培養(yǎng)中，添加椰子汁后細胞生長速率加緊，耗氧量比不添加椰子汁時顯著增大。另外，也有報道，Acer．PsedoplatanusL．細胞培養(yǎng)中，細胞體內(nèi)含氮量與耗氧量有正比關系。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第25頁普通好氧微生物比生長速率u與菌體維持常數(shù)m及氧比消耗速率Qo2有以下關系：生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第26頁據(jù)加藤等所取得煙草細胞分批培養(yǎng)結果表明，當氧為細胞生長限制性原因時,u與Q02有與(5—1)式相同關系。這說明，植物細胞培養(yǎng)中氧消耗，部分用于維持代謝，部分用于生長繁殖，所取得m＝0．09mmol／(g·h)，Y＝0．061g／mmol，與普通微生物m和Y值相比，m很小而Y較大。這可能是植物細胞培養(yǎng)過程中主要特征。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第27頁5．2．1．3胞內(nèi)物質(zhì)與生長模型

微生物培養(yǎng)中，把細胞內(nèi)RNA含量作為描述其生長速率指標，且隨微生物比生長速率增加，RNA含量增大。植物細胞培養(yǎng)中，也有類似報道。吉田等在進行人參細胞培養(yǎng)中發(fā)覺，在對數(shù)生長久，細胞RNA含量顯著增大。培養(yǎng)煙草細胞時，人們詳細研究了細胞比生長速率與細胞內(nèi)RNA關系，發(fā)覺其與普通微生物相同，能夠用一次方程表示，即生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第28頁總而言之，動植物細胞生長動力學研究，在很大程度上是借鑒了微生物反應動力學理論。從已經(jīng)有實例看，又多屬于定性探討。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第29頁5．2．2動植物細胞培養(yǎng)操作

5．2．2．1植物細胞培養(yǎng)操作植物細胞培養(yǎng)方式依據(jù)植物細胞所處狀態(tài)不一樣，分為懸浮培養(yǎng)法與固定化植物細胞培養(yǎng)法，依據(jù)操作方式不一樣，又分為分批式、重復分批式和連續(xù)式培養(yǎng)3種。下面以懸浮培養(yǎng)法(分批、重復分批和連續(xù)培養(yǎng))為例進行介紹。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第30頁(1)分批培養(yǎng)植物細胞分批培養(yǎng)與微生物分批培養(yǎng)類同。因為操作簡單，從試驗室到大型罐廣泛應用。分批培養(yǎng)中，植物細胞生長曲線普通呈s形，可顯著觀察出誘導期、對數(shù)生長久、減速期、靜止期和衰亡期(死亡期)，不過與細菌和酵母菌培養(yǎng)相比，即使是生長速率快煙草細胞，分批培養(yǎng)時間(一個周期)也要6d以上，這也就是前面所說植物細胞培養(yǎng)先天不足——生長遲緩。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第31頁表5—2表示一些植物細胞分批培養(yǎng)中對數(shù)生長久u與微生物比較。即使已知生長較快煙草細胞平均世代時間也要15．8h(u＝0.044h-1)，不到酵母比生

長速率l／10。所以，有必要開發(fā)長久無菌培養(yǎng)技術。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第32頁生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第33頁當前，不論在試驗室還是在工廠中，大至20t罐，廣泛采取分批式操作。藤田開發(fā)二步培養(yǎng)法是分批培養(yǎng)法一個變形，同時使用兩個反應器，第一個反應器主要是為大量培養(yǎng)細胞，第二個反應器是為增加目標產(chǎn)物含量。分批培養(yǎng)中，在一定范圍內(nèi)增加底物濃度，可增加目標產(chǎn)物產(chǎn)量，但濃度過高又會造成接種細胞死亡。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第34頁(2)重復式分批培養(yǎng)若反應器內(nèi)培養(yǎng)液體積為V，補加量為F'(等于取出量)，則比值F'／V稱為替換率D'。D'與連續(xù)培養(yǎng)中稀釋率D不一樣，其與培養(yǎng)液取出至加入完成期間比生長速率u'有以下關系：生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第35頁生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第36頁(3)連續(xù)培養(yǎng)因為連續(xù)培養(yǎng)能夠確保細胞生長環(huán)境長時間穩(wěn)定，所以，在研究細胞生理或代謝等方面時，連續(xù)培養(yǎng)是一個主要培養(yǎng)方法。與微生物連續(xù)培養(yǎng)相同，對于單罐連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，與細胞生長相關物料衡算式為：生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第37頁生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第38頁生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第39頁普通連續(xù)培養(yǎng)細胞產(chǎn)率高于分批培養(yǎng)，但因為植物細胞生長速率慢，維持長時間無菌狀態(tài)是需要處理基本技術問題。另外，單罐連續(xù)培養(yǎng)法并不能適應各種反應，所以，有必要開發(fā)一些新方法。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第40頁5．2．2．2動物細胞培養(yǎng)方法

動物細胞培養(yǎng)方法有兩種類型，一類是非貼壁依賴性細胞培養(yǎng)，起源于血液、淋巴組織細胞，許多腫瘤細胞(包含雜交瘤細胞)和一些轉化細胞屬于這一類型，其可采取類似微生物培養(yǎng)方法進行懸浮培養(yǎng)。另一類是貼壁依賴性細胞培養(yǎng)，大多數(shù)動物細胞，包含非淋巴組織細胞和許多異倍體體系細胞屬于這一類型，它們需要附著于適量正電荷固體或半固體表面生長。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第41頁能夠進行懸浮培養(yǎng)動物細胞是一類能無限繁殖細胞，這么細胞又稱為確立細胞株。因為動物細胞對剪切力敏感，豐富培養(yǎng)基輕易形成過多泡沫，這都增加了反應器操作難度。懸浮培養(yǎng)多采取分批式操作方法，其原理與植物細胞類同。另外，適合用于動物細胞還有一個連續(xù)式操作方法——灌流培養(yǎng)法。這種方法是把細胞置于某種封閉系統(tǒng)中，連續(xù)注入新鮮培養(yǎng)基同時，連續(xù)等量排出用過培養(yǎng)基，但不排出懸浮細胞。

生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第42頁采取這種方法后，從產(chǎn)物開始分泌時起，便可用快速純化方法不停地從流出培養(yǎng)基中搜集目標產(chǎn)物。即使灌流培養(yǎng)系統(tǒng)含有以上優(yōu)點，但也存在培養(yǎng)基消耗量比普通懸浮培養(yǎng)高幾倍，工作過程復雜，培養(yǎng)物易受污染和培養(yǎng)細胞不穩(wěn)定等缺點。生化反應器動植物細胞培養(yǎng)動力學專家講座第43頁灌流培養(yǎng)系統(tǒng)可分為3類：