微生物實(shí)驗(yàn)三

注意！此次試驗(yàn)部分包括生物危險(xiǎn)(糞便中致病微生物)，請(qǐng)慎重操作(無菌操作)！微生物實(shí)驗(yàn)三第1頁內(nèi)容提要一腸道桿菌判定（2課時(shí)）革蘭染色（1片/人），雙糖鐵培養(yǎng)基接種（8支/室），玻片凝集試驗(yàn)（1片/人）二藥敏試驗(yàn)（0.5課時(shí)）介紹及展示示教平板三抗酸染色（2.5課時(shí)）示教，1片/人微生物實(shí)驗(yàn)三第2頁一腸道桿菌判定（2課時(shí)）微生物實(shí)驗(yàn)三第3頁病原菌檢驗(yàn)程序增菌培養(yǎng)革蘭染色分離培養(yǎng)接種瓊脂斜面純培養(yǎng)采集標(biāo)本生化試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)分析判定革蘭染色觀察菌落特征微生物實(shí)驗(yàn)三第4頁概念：用生化方法來檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)代謝作用及代謝產(chǎn)物，借以判別細(xì)菌種類，這種生化試驗(yàn)稱為細(xì)菌生化反應(yīng)試驗(yàn)。意義：是判別細(xì)菌主要依據(jù)。1.細(xì)菌生化反應(yīng)微生物實(shí)驗(yàn)三第5頁生化反應(yīng)碳水化合物代謝試驗(yàn)各種酶類試驗(yàn)抑菌試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸代謝試驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)IMViC試驗(yàn)微生物實(shí)驗(yàn)三第6頁糖發(fā)酵試驗(yàn)[原理]依據(jù)細(xì)菌分解利用糖能力差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為判定菌種依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后依據(jù)指示劑顏色改變來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。微生物實(shí)驗(yàn)三第7頁1、確定細(xì)菌是否生長(zhǎng)2、產(chǎn)酸，則培養(yǎng)基指示劑（溴甲酚紫）變?yōu)辄S色，以“+”表示。3、產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基除變黃外，在倒置小管中有氣泡，用“

”表示。4、不發(fā)酵糖類，培養(yǎng)基仍為紫色，小管內(nèi)無氣泡，以“-”表示。[結(jié)果][方法]取糖發(fā)酵管培養(yǎng)基，此時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)呈澄清、紫色，倒立小管內(nèi)無氣泡，接種細(xì)菌后置37℃溫箱培養(yǎng)18－二十四小時(shí)，觀察結(jié)果。微生物實(shí)驗(yàn)三第8頁大腸桿菌傷寒桿菌副傷寒桿菌葡萄糖+乳糖--微生物實(shí)驗(yàn)三第9頁硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)

[原理]一些細(xì)菌能分解蛋白質(zhì)中含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氫。硫化氫遇培養(yǎng)基中鉛鹽或鐵鹽，形成黑色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。[方法]分別穿刺接種大腸桿菌、傷寒桿菌至兩管雙糖鐵培養(yǎng)基中。37℃孵育二十四小時(shí)后觀察結(jié)果。微生物實(shí)驗(yàn)三第10頁[結(jié)果]沿穿刺線部位呈黑褐色，表明有硫化氫產(chǎn)生，為陽性以“+”表示，不變色者為陰性，以“-”表示。大腸桿菌：-傷寒桿菌：+微生物實(shí)驗(yàn)三第11頁2.腸道桿菌判定試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：熟悉病原性桿菌普通判定過程微生物實(shí)驗(yàn)三第12頁糞便→增菌培養(yǎng)（必要時(shí)）↓

SS培養(yǎng)基↓雙糖鐵培養(yǎng)基┒

↓↓

生化反應(yīng)血清學(xué)判定←┛腸道桿菌判定程序已完成革蘭染色微生物實(shí)驗(yàn)三第13頁大腸桿菌在SS平板上菌落特點(diǎn)；傷寒桿菌在SS平板上菌落特點(diǎn)；（1）觀察SS平板上菌落特點(diǎn)

SS平板大腸桿菌粉紅色大菌落痢疾桿菌無色細(xì)小半透明菌落傷寒桿菌無色細(xì)小半透明菌落微生物實(shí)驗(yàn)三第14頁（2）雙糖鐵培養(yǎng)基接種雙糖鐵培養(yǎng)基成份含有乳糖和葡萄糖：產(chǎn)酸產(chǎn)氣含有硫酸亞鐵：如細(xì)菌分解含硫氨基酸生成硫化氫，可形成黑色沉淀酚紅指示劑：

酸：黃堿：紅微生物實(shí)驗(yàn)三第15頁各菌生長(zhǎng)特點(diǎn)1)大腸桿菌發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（糖發(fā)酵試驗(yàn)），是斜面及底層均呈黃色并有氣泡。2)沙門菌和志賀菌只發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵乳糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降，酚紅指示劑變黃，不過培養(yǎng)基中葡萄糖僅有0.1%，在斜面酸性物質(zhì)被氧化成揮發(fā)性酸，且細(xì)菌氧化氨基酸物質(zhì)產(chǎn)生氨中和作用，使斜面變紅，而底層則為黃色。微生物實(shí)驗(yàn)三第16頁雙糖鐵培養(yǎng)基接種方法將可疑菌落接種于雙糖鐵培養(yǎng)基上（穿刺+斜面），37度培養(yǎng)二十四小時(shí)，第二天觀察結(jié)果。微生物實(shí)驗(yàn)三第17頁雙糖鐵培養(yǎng)基上各菌生長(zhǎng)現(xiàn)象大腸桿菌黃色有氣泡傷寒桿菌上紅下黃中間有黑色沉淀福氏痢疾桿菌上紅下黃微生物實(shí)驗(yàn)三第18頁沖洗染色完成之后，在涂片區(qū)滴上香柏油使用油鏡觀察試驗(yàn)結(jié)果（3）革蘭染色方法與步驟

1、細(xì)菌涂片制備

涂片干燥固定

2、染色

初染（結(jié)晶紫）媒染（盧戈氏碘液）脫色（95%乙醇）復(fù)染（稀釋石碳酸復(fù)紅）

吸水紙吸干

1min1min30s30s沖洗沖洗沖洗微生物實(shí)驗(yàn)三第19頁（4）傷寒桿菌玻片凝集試驗(yàn)原理：

當(dāng)顆粒性抗原與其對(duì)應(yīng)抗體特異結(jié)合時(shí)，在電解質(zhì)存在下，二者百分比適當(dāng)時(shí)，可出現(xiàn)凝集顆粒，此現(xiàn)象稱凝集反應(yīng)。微生物實(shí)驗(yàn)三第20頁試劑與器材沙門氏菌屬A—E群多價(jià)O血清，SS平板上菌落，玻片、消毒缸、酒精燈，記號(hào)筆等。方法1.取清潔玻片一張，用記號(hào)筆劃分成兩部分。用移液槍分別在兩邊加沙門氏菌屬A-E群多價(jià)O血清8微升。2.無菌操作下用接種環(huán)分別取少許SS平板上菌落（黑色或無色菌落，以及粉紅色大菌落）與血清混合成均勻乳狀(注意：取菌量不宜過多，使懸液呈輕度乳濁即可)。3.輕輕搖動(dòng)玻片，經(jīng)1-2min后觀察結(jié)果。微生物實(shí)驗(yàn)三第21頁注意事項(xiàng)：注意涂菌時(shí)，標(biāo)明菌落，以免混同產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果之后，將玻片放入含消毒液指定容器內(nèi)，切勿任意放置或沖洗。

結(jié)果觀察液體變清，并有乳白色凝集塊出現(xiàn)者為陽性。液體依然混濁，無凝集塊出現(xiàn)者為陰性。如待檢菌與沙門氏菌屬A-E群多價(jià)O血清發(fā)生凝集，則該菌為沙門氏菌屬。微生物實(shí)驗(yàn)三第22頁（5）結(jié)果判斷

SS平板：菌落形態(tài)，顏色；雙糖鐵培養(yǎng)基上生化特點(diǎn)；革蘭染色：形態(tài)，排列，染色特點(diǎn)；

玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果

微生物實(shí)驗(yàn)三第23頁此次試驗(yàn)所做內(nèi)容桿菌判定⑴觀察菌落特征（SS平板）⑵取可疑菌落做革蘭染色4片/臺(tái)⑶將可疑菌落接種于雙糖鐵培養(yǎng)基上（穿刺+斜面），37度培養(yǎng)二十四小時(shí)，觀察結(jié)果.1支/臺(tái)⑷傷寒桿菌玻片凝集試驗(yàn)微生物實(shí)驗(yàn)三第24頁二藥敏試驗(yàn)（0.5課時(shí)）微生物實(shí)驗(yàn)三第25頁目標(biāo)要求1.掌握紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)原理及結(jié)果判定2.了解藥敏試驗(yàn)操作方法和意義微生物實(shí)驗(yàn)三第26頁原理含有定量抗菌藥品紙片貼在已接種測(cè)試菌瓊脂平板上，紙片中所含藥品吸收瓊脂中水分溶解后便不停地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反應(yīng)測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥品敏感程度。微生物實(shí)驗(yàn)三第27頁主要材料1.大腸桿菌菌液普通瓊脂平板2.含抗生素濾紙片：青霉素氯霉素鏈霉素慶大霉素微生物實(shí)驗(yàn)三第28頁方法標(biāo)識(shí)分區(qū)密涂接種貼片培養(yǎng)結(jié)果觀察微生物實(shí)驗(yàn)三第29頁1.標(biāo)識(shí)分區(qū)底部觀微生物實(shí)驗(yàn)三第30頁2.密涂接種

分三次接種，每次取一環(huán)。第一次密涂接種后旋轉(zhuǎn)60度二次密涂接種，然后同方向旋轉(zhuǎn)60度后再次密涂接種。頂部觀微生物實(shí)驗(yàn)三第31頁3.貼片底部觀微生物實(shí)驗(yàn)三第32頁4.培養(yǎng)置37℃溫箱，倒置培養(yǎng)18h-24h微生物實(shí)驗(yàn)三第33頁青霉素鏈霉素慶大霉素氯霉素

五、結(jié)果抑菌圈抑菌圈直徑微生物實(shí)驗(yàn)三第34頁結(jié)果觀察抑菌圈直徑≥15mm高度敏感抑菌圈直徑10-15mm中度敏感抑菌圈直徑≤10mm低度敏感無抑菌圈不敏感或耐藥微生物實(shí)驗(yàn)三第35頁注意事項(xiàng)接種時(shí)均勻密涂貼片時(shí)，用無菌鑷子輕輕觸壓藥品紙片使之與培養(yǎng)基充分接觸貼片后不能再更改紙片位置鑷取藥品紙片時(shí)一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不一樣抗生素交叉影響整個(gè)貼片過程應(yīng)在15min內(nèi)完成微生物實(shí)驗(yàn)三第36頁一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：1、掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本制備2、掌握抗酸染色原理和方法三抗酸染色微生物實(shí)驗(yàn)三第37頁分枝桿菌細(xì)胞壁內(nèi)含有大量脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在肽聚糖外面，所以分枝桿菌普通不易著色，要經(jīng)過加熱和延長(zhǎng)染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中分枝菌酸與染料結(jié)合后，就極難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色。齊-尼氏抗酸染色法是在加熱條件下使分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅牢靠結(jié)合成復(fù)合物，用鹽酸酒精處理也不脫色。當(dāng)再加堿性美蘭復(fù)染后，分枝桿菌依然為紅色，而其它細(xì)菌及背景中物質(zhì)為蘭色。二、試驗(yàn)原理：微生物實(shí)驗(yàn)三第38頁三、試驗(yàn)材料：細(xì)菌：卡介苗（BacillusCalmette-Guerin，BCG）染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等微生物實(shí)驗(yàn)三第39頁四、試驗(yàn)方法：1、細(xì)菌涂片標(biāo)本制備涂片干燥固定2、染色1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處漸漸加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)降低，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色：3%鹽酸酒精脫色30’’~1’；用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1’；用水沖洗后用吸水紙吸干。微生物實(shí)驗(yàn)三第40頁3、油鏡觀察未染色初染后脫色后復(fù)染后初染脫色復(fù)染鏡檢微生物