高考生物二輪復(fù)習(xí)第2講基因工程大題講解

【課前自主學(xué)習(xí)檢查】1、基因工程的概念？2、重組DNA技術(shù)的基本工具有哪些？3、限制性核酸內(nèi)切酶的來源？4、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)？5、限制性核酸內(nèi)切酶的作用結(jié)果？6、DNA連接酶的作用部位？7、DNA連接酶的種類？8、基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？今日寄語：第3講基因工程

大題強(qiáng)化練講評本節(jié)主要解決的困惑引物的設(shè)計(jì)與計(jì)算限制酶的選擇及酶切產(chǎn)物的計(jì)算（1）重疊延伸PCR①此技術(shù)共需四個(gè)引物引物2和引物3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基（包括突變位點(diǎn)）是可以互補(bǔ)的。②分別利用引物1和引物2，引物3和引物4進(jìn)行PCR，得到兩個(gè)DNA片段③得到的DNA片段可以通過引物2和引物3互補(bǔ)的堿基雜交在一起，它們再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。④最后，用引物1和引物4進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段?；蚨c(diǎn)突變技術(shù)1．PCR定點(diǎn)突變技術(shù)需要____輪能得到等長的DNA片段例1：（多選）重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經(jīng)過多次PCR擴(kuò)增。從而獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)誘變等方而具有廣泛的應(yīng)用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過程。下列敘述正確的是（

）A．引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結(jié)合的穩(wěn)定性越高B．在第一階段由于引物2和引物3發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，因此兩者置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中C．引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生4種雙鏈DNA分子D．引物1、2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過3次復(fù)制AB（2）大引物PCR①大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。②首先利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；③利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物片段中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA選擇哪條鏈作為下游大引物？例2：定點(diǎn)誘變技術(shù)是近年來生物工程研究中發(fā)展迅速的一個(gè)領(lǐng)域。通過定點(diǎn)誘變可以在體外改造目的DNA分子，進(jìn)而研究基因的表達(dá)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。經(jīng)典的大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)成為基于PCR的定點(diǎn)誘變技術(shù)中應(yīng)用最普遍的方法，操作過程如圖甲。研究者欲改造某基因并將其導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒中保存，該質(zhì)粒含有氨青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)如圖乙?；卮鹣铝袉栴}：(1)利用大引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變需要進(jìn)行兩輪PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要_________個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板。在PCR2中，要獲得帶有誘變點(diǎn)的改良基因，引物應(yīng)選用大引物兩條鏈中的_________（填“①”或“②”）。2②5.水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位地天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）替換為賴氨酸（密碼子為AAA、AAG），從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理見下圖。重疊延伸PCR技術(shù)∶一項(xiàng)重要的基因定點(diǎn)突變技術(shù)，其主要設(shè)計(jì)思路是用具有互補(bǔ)配對片段的引物（圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)），分別進(jìn)行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。（1）由以上事例可知，要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過______來完成。（2）若擬突變位點(diǎn)的堿基對為A-T，則需要讓其突變?yōu)開______才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)（突起處）應(yīng)設(shè)計(jì)為__________（假設(shè)引物為單鏈DNA）。（3）在第一階段獲得兩種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)開_____________。（4）利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí)，特別要注意的問題是_____________________?！敬鸢浮?/p>

(1).改造基因（基因定點(diǎn)突變）

(2).T-A或C-G(3).A或G(4).3(5).引物2和3中存在互補(bǔ)配對片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用

(6).M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對的片段【當(dāng)堂檢測】4.C困惑點(diǎn)一：基因工程1.1985年穆里斯等人發(fā)明了PCR技術(shù)。請回答有關(guān)問題：（1）若要使用PCR擴(kuò)增目的基因，則需要在反應(yīng)體系中添加的物質(zhì)有4種脫氧核昔酸、引物、模板和______________________，其中引物的作用是________________________________________________________。（2）PCR中每次循環(huán)的步驟依次是_____________________。PCR的產(chǎn)物常用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，在凝膠中DNA分子的遷移速率與_________________________________有關(guān)。（3）利用PCR技術(shù)可以從蘇云金桿菌DNA分子中擴(kuò)增出Bt基因，原因是_________________________________________，至少需要____輪循才能得到只含有Bt基因的片段，經(jīng)過5輪復(fù)制，需要引物____個(gè)，其中只含有Bt基因的片段占總DNA片段的比例為_________。耐高溫的DNA聚合酶

使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3，端開始連接脫氧核苷酸

變性、復(fù)性和延伸

凝膠的濃度、DNA空子的大小和構(gòu)象引物是根據(jù)Bt基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的36211/16到第三輪循環(huán)時(shí)，才開始出現(xiàn)2個(gè)兩條脫氧核苷酸鏈等長（即目的基因片段）的子代DNA。（即目的基因片段）經(jīng)過5輪復(fù)制，由于兩條模板鏈不需要引物，所以需要引物的個(gè)數(shù)為2×25-2=62個(gè)引物。利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程到第三輪循環(huán)時(shí)，才開始出現(xiàn)2個(gè)兩條脫氧核苷酸鏈等長（即目的基因片段）的子代DNA。注：1）復(fù)制三次后，只有C上和B下才是目的基因X，所以3次復(fù)制只得到2個(gè)目的基因。2）如果進(jìn)行4次復(fù)制可得到8個(gè)目的基因。A下可得一個(gè)目的基因；B上得一個(gè)，B下得二個(gè)；C上得二個(gè)，C下得一個(gè)；D上得一個(gè)3）復(fù)制次數(shù)和目的基因X的關(guān)系式是：目的基因（2個(gè)兩條脫氧核苷酸鏈等長）的個(gè)數(shù)=2n-2n經(jīng)過5輪復(fù)制后，其中只含有Bt基因的片段占總DNA片段的計(jì)算如下：目的基因的個(gè)數(shù)是=2n-2n=25-2×5=22，DNA分子的總數(shù)是25=32，所以其中只含有Bt基因的片段占總DNA片段的11/16。【點(diǎn)撥提升1】2．（11分）水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是全球約半數(shù)人口的主糧。然而水稻只有在磷充足的條件下才能保證高產(chǎn)。S基因是番茄線粒體中的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，科研人員將S基因轉(zhuǎn)入水稻體內(nèi)，以期望獲得低磷條件下的高產(chǎn)水稻。操作流程如下：（1）由番茄細(xì)胞的總RNA得到cDNA，需要的酶是_____________。從cDNA文庫中獲取的S基因往往需要利用PCR技術(shù)在引物的______端添加限制酶識(shí)別序列。已知Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄方向?yàn)轫槙r(shí)針，相關(guān)酶切位點(diǎn)如下表。通過測序已知S基因部分序列如下：5′-ATGGAGAA……CTCCTT-CT-3'3′-TACCTCTT……CAGGAAGA-5′請補(bǔ)充擴(kuò)增結(jié)束后，大多數(shù)DNA片段的堿基對序列_________________________。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作，該工作的重要意義是____________________________________?；虮磉_(dá)載體除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須含有__________和__________。（3）圖中兩處篩選時(shí)均需在培養(yǎng)基中加入____________。已知GUS基因的產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，若______________________________________________________，則說明S基因在水稻愈傷組織細(xì)胞中已成功表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄酶

5′使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用啟動(dòng)子

終止子氨芐青霉素

經(jīng)無色物質(zhì)K處理愈傷組織并篩選出了呈現(xiàn)藍(lán)色的組織1、基因工程的原理是基因重組。2、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。必背知識(shí)點(diǎn)C【變式練習(xí)1】3.科學(xué)家首次運(yùn)用基因工程的手段，導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)纖維高產(chǎn)基因KCS，可提高我國棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。經(jīng)過十多年艱苦實(shí)驗(yàn)、不斷培育，將我國棉花纖維的長度提高了0.3厘米，如今新疆棉花品質(zhì)位居世界前列。如圖1表示含有目的基因KCS的DNA片段長度(bp即堿基對)和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有MspI、BamHI、MboI、SmaI4種限制性內(nèi)切核酸酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。據(jù)圖回答下列問題：（1）培育轉(zhuǎn)基因棉花需要用到的工具有_____________________。（2）若用限制酶SmaI完全切割圖中含有目的基因D的DNA片段，其產(chǎn)物長度分別為___________。（3）基因工程中使用的目的基因主要是指____________________。重組質(zhì)粒中除目的基因外，還必須有_____________________。（4）若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是_______。經(jīng)檢測，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最有可能的原因是____________________。（5）導(dǎo)入目的基因的植物細(xì)胞，經(jīng)過植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到幼苗，該技術(shù)利用的原理是______。為了提高轉(zhuǎn)基因的成功率，需要通過PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，以獲得目的基因的大量拷貝。（6）在目的基因進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，加入的引物有A、B兩種，引物的作用是_____________________________________，若該目的基因擴(kuò)增n代，則其中含有A、B引物的DNA分子有______個(gè)。（7）PCR過程中退火(復(fù)性)溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定。如表為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對引物序列，如圖為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度:_______________。理由是____________________________。引物對AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAC引物對BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCGG-C之間為三個(gè)氫鍵，A-T之間為兩個(gè)氫鍵，氫鍵越多，DNA穩(wěn)定性越強(qiáng)，由于引物對B中含有C-G堿基對多于引物對A，所以需要的退火溫度高引物對序列表限制酶、DNA連接酶、載體

537bp、790bp、661bp編碼蛋白質(zhì)的基因

啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)

BamHI同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反向連接

植物細(xì)胞具有全能性

使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始復(fù)制

2n-2引物對B4.乙烯具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄細(xì)胞內(nèi)合成乙烯的兩個(gè)關(guān)鍵酶。利用反義DNA技術(shù)(原理如圖1)，可以抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，從而使番茄具有耐儲(chǔ)存、宜運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)。圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反義基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖?；卮鹣铝袉栴}：（1）從番茄細(xì)胞中提取RNA，利用RT-PCR技術(shù)獲取ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，即利用RNA和PCR獲取目的基因。該技術(shù)獲取目的基因所需要的酶主要有_____________________________________。（2）合成出的ACC氧化酶基因兩端分別含限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，ACC合成酶基因兩端含KpnⅠ和Sau3AⅠ的酶切位點(diǎn)，這四種限制酶及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下圖：限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠG↓AATTCSau3AⅠ↓GATC先用限制酶_________________分別對ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因進(jìn)行切割后，再將它們拼接成融合基因，相應(yīng)的Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶________________進(jìn)行切割，以確保融合基因能夠插入載體中。載體上卡那霉素抗性基因的作用是_____________________。（3）為了獲得耐運(yùn)儲(chǔ)存、宜儲(chǔ)存的番茄，應(yīng)將融合基因________(填“正向”或“反向”)插入啟動(dòng)子2A11的下游，原因是___________。（