犬傳染性肝炎診斷技術(shù)

中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：田克恭、王宏偉、遇秀玲、陳西釗、王傳彬、楊秀勇。11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了犬傳染性肝炎(ICH)的臨床診斷、犬傳染性肝炎病毒(ICHV)的分離與鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫酶組織化學(xué)方法等診斷技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于犬傳染性肝炎的診斷。2臨床診斷要點(diǎn)2.1臨床癥狀最急性病例，患犬在嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀出現(xiàn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。急性型病例，患犬體溫呈馬鞍過性混濁，即“藍(lán)眼”病，有的出現(xiàn)潰瘍。慢性病例多發(fā)于老疫區(qū)或疫病流行后期，患犬多不死亡，可以2.2病理變化病犬主要表現(xiàn)全身性敗血癥變化。在實(shí)質(zhì)器官、漿膜、粘膜上可見大小、數(shù)量不等的出血斑點(diǎn)。肝腫大，呈斑駁狀，表面有纖維素附著。膽囊壁膽囊的變化具有一定的診斷意義。3病毒分離與鑒定3.1材料準(zhǔn)備3.1.1試劑3.1.1.1改良最低要素營養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基，配方見第A.1章。3.1.1.2犬腎傳代細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)。3.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：ICHV單克隆抗體，中和抗體效價(jià)1:1024。3.1.1.4標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無ICHV感染的犬血清。3.1.2器材a)細(xì)胞培養(yǎng)瓶；b)吸管；c)二氧化碳培養(yǎng)箱；d)37℃恒溫水浴箱；e)普通冰箱及低溫冰箱；f)離心機(jī)及離心管；g)研磨器械；h)普通光學(xué)顯微鏡；j)0.45μm微孔濾膜。3.1.3樣品ICHV存在于病犬扁桃體、肝臟、脾臟等組織器官中。無菌采集這些器官用無血清DMEM制成20%組織懸液，3000r/min離心30min。取上清10000r/min離心20min,取上清用于ICHV分離。23.2操作方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用含8%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)MDCK細(xì)胞。每3d～4d傳代一次，細(xì)胞長成單層時(shí)，用于ICHV分離。3.2.2病料接種將0.1mL處理好的組織懸液接種MDCK細(xì)胞，37℃吸附1h,加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)3d~5d,觀察結(jié)果。3.2.3結(jié)果觀察ICHV感染MDCK細(xì)胞3d～5d表現(xiàn)為細(xì)胞增大變圓、變亮、折光性增強(qiáng)、聚集成葡萄串狀。若第一次接種未出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代。如仍無細(xì)胞病變，則判為ICHV檢測陰性。3.2.4ICHV的鑒定將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，用1%人“O”型紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn)，血凝試驗(yàn)陽性者，再用ICHV單克隆抗體進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，鑒定毒株。4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)4.1材料準(zhǔn)備4.1.1.1ELISA抗原包被板。4.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：用ICHV抗原免疫犬獲得的血清。4.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無ICHV感染的犬血清。4.1.1.4酶結(jié)合物：辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗犬IgG。4.1.1.5磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.2章。4.1.1.6洗滌液：配制見第A.3章。4.1.1.7樣品稀釋液：配制見第A.4章。4.1.1.8底物溶液：配制見第A.6章。4.1.1.9終止液：配制見第A.7章。4.1.2器材a)酶聯(lián)檢測儀；c)37℃恒溫培養(yǎng)箱。采集被檢犬血液，分離血清。血清應(yīng)新鮮、透明、不溶血、無污染，密裝于滅菌小瓶內(nèi)，4℃或-30℃保存或立即送檢。試驗(yàn)前將被檢血清統(tǒng)一編號(hào)，并用樣品稀釋液作1:160倍稀釋。4.2操作方法4.2.1試驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各兩孔和空白對(duì)照一孔。4.2.2在微孔反應(yīng)板孔中加入1:160稀釋的待檢血清、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清各100μL,充分混勻后，置37℃作用20min。4.2.3棄去各孔中液體、甩干。每孔加滿洗滌液漂洗三次，每次2min,甩干。4.2.4每孔加入酶結(jié)合物100μL,置37℃作用20min。4.2.5重復(fù)4.2.3。4.2.6每孔加入底物液100μL,置37℃避光顯色10min。4.2.7每孔加入終止液50μL,置酶聯(lián)檢測儀于450nm波長測定各孔吸光度(OD)值。34.3結(jié)果判定4.3.1陽性對(duì)照血清OD值≥0.8;陰性對(duì)照血清OD值≤0.1,試驗(yàn)成立。4.3.2若陰性對(duì)照OD均值一空白對(duì)照OD值小于0.03,按0.03計(jì)算。4.3.3臨界值的計(jì)算：臨界值=0.17+(陰性血清對(duì)照孔OD均值一空白對(duì)照孔OD值)。4.3.4待檢樣本的OD值-空白對(duì)照OD值所得的差≥臨界值，即判為ICHV抗體具有保護(hù)效價(jià)；小于臨界值，即判為ICHV抗體未達(dá)到保護(hù)效價(jià)。5免疫酶組織化學(xué)法5.1材料準(zhǔn)備5.1.1.1磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.2章。5.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：ICHV單克隆抗體，中和抗體效價(jià)1:1024。5.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：無ICHV感染的犬血清。5.1.1.4酶結(jié)合物：HRP標(biāo)記的SPA。5.1.1.5底物溶液：配制見第A.8章。5.1.1.6過氧化氫甲醇溶液：配制見第A.9章。5.1.1.7鹽酸酒精溶液：配制見第A.10章。5.1.1.8胰蛋白酶溶液：配制見第A.11章。a)普通光學(xué)顯微鏡；c)石蠟切片機(jī)或冷凍切片機(jī)；d)載玻片及蓋玻片；e)37℃恒溫培養(yǎng)箱或水浴箱。對(duì)疑似ICHV的病死犬或撲殺犬，立即采集肝、扁桃體等組織數(shù)小塊，置冰瓶內(nèi)立即送檢。不能立即送檢者，將組織塊切成1cm×1cm左右大小，置體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液中固定，保存，送檢。5.2操作方法5.2.1新鮮組織按常規(guī)方法制備冰凍切片。冰凍切片風(fēng)干后用丙酮固定10min～15min;新鮮組織或固定組織按常規(guī)方法制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟至PBS(切片應(yīng)用白膠或鉻礬明膠做粘合劑，以防脫片)。5.2.2去內(nèi)源酶：用過氧化氫甲醇溶液或鹽酸酒精溶液37℃作用20min。5.2.3胰蛋白酶消化：室溫下，用胰蛋白酶溶液消化處理2min,以便充分暴露抗原。5.2.5封閉：滴加體積分?jǐn)?shù)為5%的新生牛血清或1:10稀釋的正常馬血清，37℃濕盒中作用30min。5.2.6加適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清或標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，37℃濕盒中作用1h或37℃濕盒中作用30min后4℃過夜。5.2.7漂洗同5.2.4。5.2.8加適當(dāng)稀釋的酶結(jié)合物，37℃濕盒作用1h。5.2.9漂洗同5.2.4。5.2.10底物顯色：新鮮配制的底物溶液顯色5min～10min后，用PBS漂洗兩次，去離子水漂洗一次。5.2.11襯染：蘇木素或甲基綠襯染細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。5.2.12從90%乙醇開始脫水、透明、封片、普通光學(xué)顯微鏡觀察。45.2.13試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。5.3結(jié)果判定陽性和陰性對(duì)照片本底清晰，背景無非特異著染，陽性對(duì)照組織細(xì)胞胞漿呈黃色至棕褐色著染，試驗(yàn)成立；被檢組織細(xì)胞胞漿、偶見胞核呈黃色至棕褐色著染，即可判為ICHV抗原陽性。6綜合判定當(dāng)在臨床上懷疑有ICHV感染時(shí)，可根據(jù)實(shí)際情況在上述方法中選一種或兩種方法進(jìn)行確診。對(duì)于未接種過ICHV疫苗的犬，采用任何一種方法檢測呈現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，都可最終判定為ICHV感染犬對(duì)于接種過ICHV疫苗的犬，當(dāng)病毒分離鑒定試驗(yàn)為陽性結(jié)果時(shí)，可最終判定為ICHV感染犬；當(dāng)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清抗體呈現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，可判為ICHV抗體具有保護(hù)效價(jià)；呈現(xiàn)陰性結(jié)果時(shí)可判為ICHV抗體未達(dá)到保護(hù)效價(jià)。5(規(guī)范性附錄)試劑的配制A.1DMEM(高糖)培養(yǎng)液A.1.1量取去離子水950mL,置于適宜的容器中。A.1.2將DMEM粉劑10g加于30℃的去離子水中，邊加邊攪拌。A.1.3每1000mL培養(yǎng)液加3.7g碳酸氫鈉。A.1.4加去離子水至1000mL,用1mol/L氫氧化鈉或鹽酸將培養(yǎng)液pH值調(diào)至pH6.9～7.0,蓋緊容器瓶塞。A.1.5立即用孔徑0.45μm的微孔濾膜正壓過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。A.2磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01mol/LpH7.4)磷酸二氫鉀0.2g十二水磷酸氫二鈉2.83g蒸餾水加至1000mLA.3洗滌液A.4樣品稀釋液含體積分?jǐn)?shù)為10%新生牛血清的洗滌液。A.5磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH5.0)g十二水磷酸氫二鈉gA.6ELISA底物溶液用二甲基亞砜將3'3'5'5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)配成1%濃度，4℃保存。使用時(shí)按下列配方配制底物溶液。磷酸鹽-檸檬酸緩沖液1