溫州大學(xué)畢業(yè)設(shè)計

本文格式為Word版下載后可任意編輯和復(fù)制第第頁溫州大學(xué)畢業(yè)設(shè)計一、背景介紹

21世紀(jì)是生物的世紀(jì)，在這樣的社會大環(huán)境下，對于生物體的討論也是更加的超前，學(xué)者們花大量的時間和精力去討論前人的試驗以及探究發(fā)覺新的結(jié)論。通過不斷的討論來探究生命的現(xiàn)象的本質(zhì)因素。自由基理論認(rèn)為細胞的代謝過程離不開氧的存在，生物氧化的過程是細胞獲得能量的過程。自由基理論把年輕與代謝聯(lián)系起來，并認(rèn)為呼吸代謝氧化磷酸化過程中產(chǎn)生過多的自由基對生物體大分子物質(zhì)的氧化損傷會加速年輕的進程，從而減短了壽命。其中最主要的是活性氧（ROS）水平。因為高ROS水平會增加氧化來損傷生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA，因此高ROS水平被認(rèn)為是削減預(yù)期壽命的緣由。

然而有關(guān)對鳥類的討論表明，有些物種的代謝率越高其壽命反而越長。此外，與保持在室溫下的小鼠相比，暴露在相對低溫狀況下的小鼠其代謝較高并且壽命也較長。對于代謝率與ROS產(chǎn)生的關(guān)系，在一些討論中發(fā)覺這兩者之間是存在著明顯的負(fù)相關(guān)，對其的一個可能的解釋是“解偶聯(lián)求生存”假說。該假說提出，解偶聯(lián)蛋白降低ROS的產(chǎn)生，通過降低線粒體內(nèi)膜的電位來實現(xiàn)的。

UCPs是線粒體膜上的轉(zhuǎn)運蛋白，迄今為止，在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)覺5種UCPs：UCP1主要分布在褐色脂肪組織中；UCP2能在白色脂肪組織、骨骼肌和免疫系統(tǒng)等多種組織中消失；UCP3主要存在于骨骼肌和脂肪組織里。UCP4和UCP5主要在大腦和肝臟中消失。UCP1調(diào)整機體產(chǎn)熱，可介導(dǎo)任意食物誘導(dǎo)的產(chǎn)熱。UCP2因為具有質(zhì)子漏功能，而削減了線粒體ROS(活性氧）產(chǎn)物的產(chǎn)生。UCP3有較強的削減ROS的產(chǎn)生和從線粒體基質(zhì)中輸出脂肪酸陰離子或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的力量，這樣可以進一步削減氧化應(yīng)激等。總的來說，UCPs能掌握線粒體內(nèi)ROS生成，與氧化應(yīng)激等過程也有親密聯(lián)系。

“解偶聯(lián)求生存”假說猜測，暴露在寒冷環(huán)境下動物的組織應(yīng)當(dāng)會降低ROS的產(chǎn)生而解偶聯(lián)蛋白的表達量會增高。但是一些討論結(jié)果并不符合解偶聯(lián)生存假說，比如暴露在寒冷環(huán)

境下大鼠的肝臟、心臟和骨骼肌中過氧化氫（H2O2）水平增加，暴露在寒冷環(huán)境下短尾田鼠的肝臟和肌肉組織蛋白質(zhì)羰基水平顯著增加。

我們設(shè)計試驗來測定溫度對黑線倉鼠的代謝率、氧化應(yīng)激、抗氧化水平和mRNA的表達的影響。我們翻閱大量的資料，認(rèn)真分析之前相關(guān)試驗的數(shù)據(jù)，以及之前試驗的相關(guān)結(jié)論，講究這些之間的相關(guān)性。并且參考之前試驗的相關(guān)原理以及試驗存在的不足之處，為我們自己的試驗做好充分的預(yù)備。從前的一個討論發(fā)覺，暴露在適度寒冷或氣溫相對溫柔的環(huán)境中，對黑線倉鼠氧化應(yīng)激和抗氧化水平并沒有造成顯著變化。當(dāng)前討論的目的是測定溫度對黑線倉鼠代謝率、氧化應(yīng)激和抗氧化水平的影響，以及與“解偶聯(lián)求生存”假說關(guān)系。

二、試驗材料

本試驗所使用的黑線倉鼠來自于河北省的農(nóng)田(115°13’E,38°12’S)，被飼養(yǎng)于溫州高校。黑線倉鼠被單獨安置在裝有適量鋸末的塑料籠子里(29×15×18cm)，定期更換潔凈的鋸末并且清理籠子；保證黑線倉鼠有充分的食物(北京科奧飼料有限公司的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物食物)和水。試驗前全部動物都安置在21±1°C溫度的環(huán)境中。

成年倉鼠3.5到4.5個月的年齡，隨機分成3組，低溫馴化組5±1°C(n=9)和暖和氣溫馴化組32.5±1°C(n=8)，對比組保存在室溫下(21±1°C)(n=8)，分別飼養(yǎng)6周。全部動物的體重和食物攝入量是每兩天測量一次并且準(zhǔn)時記錄數(shù)據(jù)。溫度處理結(jié)束后，對各個組的組織樣品進行收集與保存。

三、試驗方法

3.1總能量攝入(GEI)，消化能量攝入(DEI)和消化率

在試驗的最終兩天對總能量攝入，消化能量攝入進行測定。將每個籠子中剩下的食物以及從木榍中挑出黑線倉鼠的糞便分別裝好，并且將黑線倉鼠的糞便置于60°C的烘箱中烘干并且測量記錄數(shù)據(jù)。食物和糞便的總能量用氧彈量熱計測定。

總能量攝入(GEI)，消化能量攝入(DEI)和消化率計算使用以下方程：

總能量攝入(kJ/d)=[食物攝入量(g/d)×飼料的干物質(zhì)含量(%)–食物碎屑]×食物總能量含量(kJ/g)；

消化能量攝入(kJ/d)=總能量攝入–[糞便干質(zhì)量(g/d)×糞便的總能量含量(kJ/g)]；

消化率(%)=消化能量攝入/總能量攝入×100%

3.2氧化應(yīng)激標(biāo)記物和抗氧化酶

試驗材料的提取，采納斷頸法取血，將黑線倉鼠處死，快速取其肩胛間的褐色脂肪組織

（BAT），腿部骨骼肌、肝臟、心臟和大腦，并且將這些試驗材料儲在液態(tài)氮中快速冷凍，以保證明驗材料的活性。組織的處理方式：根據(jù)肯定的質(zhì)量配比將組織放置到冰冷的0.9%的氯化鈉溶液中進行勻漿，然后再放到離心機中用3000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速對其進行離心，15分鐘后取其上清液保存在相宜的環(huán)境中待后續(xù)試驗分析。用Lowry法測定蛋白質(zhì)濃度。使用(南京建成生物工程討論所)生產(chǎn)的試劑測定過氧化氫（H2O2）水平，并通過對過氧化氫水平的測定來分析分析黑線倉鼠的氧化應(yīng)激水平。過氧化氫（405nm）的水平表示為毫摩爾/克蛋白質(zhì)（mmol/gprotein）。

丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標(biāo)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，用硫代巴比妥酸（TBA）在532nm波進步行測定，并且產(chǎn)生具有粉紅色的產(chǎn)物。組織MDA水平表示為納摩爾/克蛋白質(zhì)（nmol/mgprotein）。

3.3總抗氧化力量（T-AOC）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性

使用(南京建成生物工程討論所)生產(chǎn)的試劑測定T-AOC和GSH-活性。在之前的大量預(yù)試驗討論中證明這些試劑都適用于黑線倉鼠。黑線倉鼠機體中有很多抗氧化物質(zhì)，能使3價的Fe還原成2價的Fe，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)和物，通過比色可測出其抗氧化力量的凹凸。在測定過程中，將待測液按肯定要求處理后用雙蒸水調(diào)零1cm光徑，520nm測各種管吸光度。定義：在37℃時，每分鐘每毫克待測液，使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時，為一個總抗氧化力量單位。

在GSH-PX活性測定的基礎(chǔ)上還原谷胱甘肽（GSH），過氧化氫產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG）和H2O反應(yīng)。GSH與二硫化碳代2硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2-硝基-5-硫代苯甲酸，可以在412nm處被檢測的黃色化合物反應(yīng)。

3.4實時RT-qPCR的分析

熒光定量PCR分析使用Trizol試劑（TAKARA，中國大連）。提取褐色脂肪組織、肝、心臟、骨骼肌和腦組織總RNA，用分光光度計測定的吸光度值確定RNA樣品濃度，然后調(diào)整到全都水平。取用調(diào)整過濃度的總RNA樣品2μL，用MLV反轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA）和oligo（dT18）引物進行cDNA的合成，反應(yīng)體系為50μL。用2μL的cDNA樣品作為模板，使用解偶聯(lián)蛋白目的基因的特定引物進行PCR反應(yīng)（表1）。

表1：用基因特異性引物序列測定實時RT-QPCR來分析解偶聯(lián)蛋白在黑線倉鼠中的表達。

Table1.Gene-specificprimersequencesusedforReal-timeRT-QPCRanalysisofuncoupling

protein(UCP)expressioninthestripedhamster.

Gene

UCP1(forward)

UCP1(reverse)

UCP2(forward)

UCP2(reverse)

UCP3(forward)

UCP3(reverse)

UCP4(forward)

UCP4(reverse)

UCP5(forward)

UCP5(reverse)

Actin(forward)

Actin(reverse)

Primers(5’to3’)GGGACCATCACCACCCTGGCAAAAAGGCTTTCTGTTGTGGCTATGCTGGCGGTGGTAGGAGATTGAAGTGGCAAGGGAGGTATGGATGCCTACAGAACCGACAATGGCGTTTCTCGTGCCGAATAATGAACCAACACCAAGGGGTCATTCTCATGCCTTGTTCCGAATCTAAATCACTCCTGACACTACCCAAAGACCTCTATGCCAACAACATCTGCTGGAAGGTGG33020890150191196Size(bp)

3.5統(tǒng)計數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，在SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。體重和食物攝入量的變化檢測使用重復(fù)測量方差分析。采納皮爾森相關(guān)系數(shù)分析來檢驗H2O2和MDA水平并T-AOC和GSH-Px活性之間的關(guān)系。P0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計學(xué)的顯著意義。運用統(tǒng)計學(xué)的方法處理和分析數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。

四、試驗結(jié)果

4.1體重和食物攝入量

3個小組黑線倉鼠的體重在試驗開頭前并沒有顯著的區(qū)分(d0，F(xiàn)2,22=0.11，P0.05，圖1A)，并且經(jīng)過六個星期的馴化后，3個小組黑線倉鼠的體重也沒有顯著的差別(d2，F(xiàn)2,22=0.45