GB-T殼聚糖含量測定 高效液相色譜法征求意見稿編制說明

一、任務(wù)來源

本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《國標(biāo)委綜合[2018]41

號(hào)》，項(xiàng)目編號(hào)“20180923-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，

定于2020年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由中國科學(xué)院海岸帶研究所等單位共同組成。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的及意義

殼聚糖是甲殼素脫乙?；a(chǎn)物，其化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1,4)-2-氨基-2-脫氧-

D-葡聚糖，是除纖維素外，自然界含量最大的天然有機(jī)高分子化合物。它是甲殼

素在堿性條件下脫乙酰度而來，殼聚糖在自然界中廣泛存在于昆蟲殼、蝦蟹殼、

軟體動(dòng)物的骨骼以及真菌的細(xì)胞壁中。其中，海洋節(jié)肢動(dòng)物的蝦蟹外殼是目前最

容易獲取并且也是量最大的資源。殼聚糖是重要的生物活性物質(zhì)，具有抑菌、抗

氧化、抗腫瘤、抗凝血、減肥降脂和增強(qiáng)免疫力等功能，并且安全無毒，具有良

好的生物相容性，可降解和成膜性等，可作為醫(yī)藥保健品、保健食品的重要原料。

因此，建立準(zhǔn)確的定量分析方法，對(duì)保障產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性都至關(guān)重要。

但目前我國仍缺乏專門檢測殼聚糖含量及純度的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，亟待建立相關(guān)標(biāo)

準(zhǔn)滿足市場需求，推動(dòng)殼聚糖在醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用，服務(wù)于殼聚糖產(chǎn)

業(yè)國際貿(mào)易。目前，測定殼聚糖含量的方法有：酸水解比色法、滴定法、氮測定

法和分光光度法、色譜法、高效毛細(xì)管電泳法、光譜法和核磁共振法等。

酸水解比色法操作比較繁瑣,且不適合微量樣品的分析。滴定法可分為酸堿滴

定法和水解滴定法，酸堿滴定法以甲基橙作指示劑，方法簡單，但由于是膠體溶

液,終點(diǎn)時(shí)指示劑變色不明顯，且終點(diǎn)時(shí)易產(chǎn)生沉淀，干擾測定；水解滴定法樣品

需水解20min,滴定要求高，操作麻煩，且不適合微量樣品的分析。氮測定法操作

繁瑣，且需根據(jù)脫乙酰度(%)計(jì)算，否則會(huì)帶來很大誤差。

分光光度法用茜素紅或溴甲酚綠與殼聚糖在一定酸度條件下的顯色反應(yīng)測定

殼聚糖的含量，且具有較高的選擇性和靈敏度，可用于不同復(fù)雜樣品中微量的殼

聚糖含量測定。但由于產(chǎn)品中色素會(huì)吸附比色杯，故其測定的線性范圍只有0-

0.2mg/mL。另外，Britton-Robinson緩沖溶液體系也可復(fù)雜樣品中微量殼聚糖的含

量的測定最近，線性范圍為0.015-0.15mg/mL。隨后，茚三酮顯色法和活性艷紅

比色法可實(shí)現(xiàn)微量殼聚糖含量的檢測，方法操作簡單，結(jié)果可靠。但測定的線性

范圍分別是0.004-0.04mg/mL和0-0.08mg/mL。由此可見，線性范圍是分光光度

法最大局限。

高效毛細(xì)管電泳法具有快速，高效，簡便，高分辨率及樣品、溶劑消耗少等

優(yōu)點(diǎn)在最近十幾年內(nèi)成為分離和分析生物活性物質(zhì)的有力工具之一，已經(jīng)被廣泛

應(yīng)用于糖類化合物。而對(duì)于高分子殼聚糖的高效毛細(xì)管電泳分析目前僅有少量文

獻(xiàn)報(bào)道。將殼聚糖進(jìn)行酸水解，然后對(duì)水解后的氨基葡萄糖用高效毛細(xì)管電泳法

和激光誘導(dǎo)熒光檢測器進(jìn)行測定，這仍然是一種間接的測定方法，并且操作較為

復(fù)雜，受水解條件影響較大。

光譜法包括紅外光譜和拉曼光譜。紅外光譜，利用殼聚糖的紅外光譜中集團(tuán)

的特征吸收峰可以進(jìn)行脫乙酰度的測定。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無需對(duì)殼聚糖樣品進(jìn)行

前處理，可直接將干燥粉末樣品與溴化鉀研成細(xì)末，壓片后在紅外光譜儀上掃描，

得到紅外光譜圖，然后用特征譜帶如酰胺Ⅰ或者酰胺Ⅱ與某個(gè)特定譜帶的吸收峰

的比值，對(duì)一系列已知的脫乙酰度作圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可測定未知?dú)?/p>

聚糖樣品的脫乙酰度。但采用紅外光譜法測定殼聚糖脫乙酰度時(shí)，由于供試品水

分造成的影響，誤差較大。拉曼光譜能快速檢測且不需要純化樣品，也不需要將

殼聚糖溶解在任何溶劑中。但其缺點(diǎn)是散射強(qiáng)度容易受光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)等因素的影

響，其他物質(zhì)的引入會(huì)對(duì)分析的結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

核磁共振，固體核磁法對(duì)殼聚糖供試品進(jìn)行表征，實(shí)現(xiàn)固體條件下13C核磁

共振信號(hào)的高分辨觀察。該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)使得對(duì)難溶或交聯(lián)的高分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的研

究成為可能。核磁共振結(jié)果用作參考數(shù)據(jù)時(shí)，可以獲得良好的精確度但是儀器昂

貴，測試費(fèi)用高。

本項(xiàng)目根據(jù)殼聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)特征識(shí)別，并結(jié)合殼聚糖含量定量測定方法，制

定殼聚糖含量測定方法的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)一部，為實(shí)現(xiàn)殼聚糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考

依據(jù)，對(duì)于推動(dòng)殼聚糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則和依據(jù)

1、以科學(xué)為依據(jù)

以科學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，結(jié)合產(chǎn)品實(shí)際生產(chǎn)情況，經(jīng)過科學(xué)研究而制定。

2、以保證產(chǎn)品安全、保護(hù)人民健康為原則

我國殼聚糖產(chǎn)業(yè)日趨發(fā)展壯大，涉及到的行業(yè)也涵蓋了制藥、食品、化工、

生物等各學(xué)科。本標(biāo)準(zhǔn)的制定充分考慮確保產(chǎn)品質(zhì)量全、及有效地促進(jìn)和滿足國

內(nèi)外市場貿(mào)易需求，以保證產(chǎn)品安全、保護(hù)人民健康。

四、主要工作過程

1、組成標(biāo)準(zhǔn)起草工作組

根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)起草任務(wù)和要求，2016年12月，由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院主持召開了

《殼聚糖含量測試技術(shù)-液相色譜法》等四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的起草小組工作會(huì)。會(huì)上，組成

了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度。會(huì)議決定由中國科學(xué)院

海岸帶研究所為主要承擔(dān)單位負(fù)責(zé)該標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。

2、開展相關(guān)調(diào)研情況

從2017年中旬開始，起草小組歷時(shí)兩個(gè)多月時(shí)間，開展了國內(nèi)外相關(guān)殼聚糖

生產(chǎn)、鑒定、含量測定方法等法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)情況調(diào)研工作。在調(diào)研中，主要查

閱了ISIWebofKnowledge平臺(tái)、中國知網(wǎng)、殼聚糖研究和生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)

和資料。

3、標(biāo)準(zhǔn)起草過程

本標(biāo)準(zhǔn)的草案的編制工作從2017年中旬就已經(jīng)開始，由中國科學(xué)院海岸帶研

究所具體承擔(dān)。本標(biāo)準(zhǔn)制定嚴(yán)格按GB/T1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的

結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》，GB/T1.2《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素

內(nèi)容的確定方法》要求進(jìn)行。

從接到標(biāo)準(zhǔn)的編制任務(wù)開始，參與編寫的人員就開始收集國內(nèi)外有殼聚糖含

量檢測的相關(guān)資料，認(rèn)真分析各種檢測方法的利弊和準(zhǔn)確性。多次通過郵件、電

話和實(shí)地考察的方式和國內(nèi)大型殼聚糖生產(chǎn)企業(yè)技術(shù)部門聯(lián)系，了解殼聚糖含量

檢測方法遇到的問題和困難，比如企業(yè)需要檢測方法易于操作等需求。通過對(duì)市

面上隨機(jī)的殼聚糖樣品和企業(yè)提供的殼聚糖樣品進(jìn)行檢測，積累了大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)

據(jù)。在大量檢測數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上完成了本標(biāo)準(zhǔn)中各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)的初步定值工作。最

后圍繞草案的具體細(xì)節(jié)問題進(jìn)行充分討論，完成了《蝦青素旋光異構(gòu)體的組成類

型及含量測定-液相色譜法》的初稿。2018年12月中旬在煙臺(tái)海岸帶研究所組織

國內(nèi)殼聚糖研究相關(guān)專家和殼聚糖生產(chǎn)企業(yè)的代表召開了三次工作組討論會(huì)議，

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案逐條逐句地進(jìn)行了討論和完善，初步形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。

五、主要技術(shù)內(nèi)容

1、原理

殼聚糖原料乙?；玫郊讱に兀謩e降解殼聚糖原料和合成后得到的甲殼素，得到含

有氨基葡萄糖鹽酸鹽的樣品溶液，采用高效液相色譜法檢測氨基葡萄糖鹽酸鹽含量，分別計(jì)

算殼聚糖純度（X）和甲殼素純度（Y），Y與X比值得到比例系數(shù)，通過比例系數(shù)計(jì)算殼聚

糖含量。

2、殼聚糖脫乙酰度測定

準(zhǔn)確稱取殼聚糖樣品0.2g于小燒杯中，加入30ml標(biāo)定的鹽酸溶液，并置于恒溫磁力攪

拌器上攪拌至溶解，加入2~3滴甲基橙-亞甲基藍(lán)指示劑，用標(biāo)定的氫氧化鈉溶液滴定樣品溶

液中過量的鹽酸，當(dāng)指示劑顏色由紫色變?yōu)榈G色，停止滴定，記錄消耗的氫氧化鈉溶液體

積，計(jì)算殼聚糖的脫乙酰度。脫乙酰度測定結(jié)果如下表1所示。

表1殼聚糖的脫乙酰度

標(biāo)示脫乙酰度實(shí)際測定脫乙酰度

%%

00.40

80.0082.42

85.0086.60

88.4387.66

95.0094.73

96.0598.34

2、樣品溶液中氨基葡萄糖鹽酸鹽含量測定

以峰面積積分值mAu為縱坐標(biāo)Y，以氨基葡萄糖鹽酸鹽濃度Ce（mg/mL）為橫坐標(biāo)X作標(biāo)

準(zhǔn)曲線，得線性方程為Y=12358.15X-2755.56，相關(guān)系數(shù)R2為0.9988。所得氨基葡萄糖鹽酸鹽

線性方程如圖1所示。從圖中可以看出，當(dāng)氨基葡萄糖鹽酸鹽在1.0~3.5mg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，

標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)較好的相關(guān)性。

圖1氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

3、殼聚糖含量測定

在相同條件測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)

溶液中的某種組分峰的保留時(shí)間一致（變化范圍在±2.5%），則認(rèn)為該色譜峰為目標(biāo)物質(zhì)出峰。

標(biāo)準(zhǔn)溶液測定色譜圖如下圖2所示，樣品溶液測定色譜圖如下圖3所示。

圖2標(biāo)準(zhǔn)樣品HPLC圖

圖3殼聚糖樣品HPLC圖

依據(jù)測定的氨基葡萄糖鹽酸鹽的濃度，分別計(jì)算殼聚糖的純度（X）和甲殼素的純度

（Y），得到Y(jié)/X比例系數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2所示。從表中可以看出脫乙酰度越大的殼聚糖，

直接降解成單糖的比例越低，計(jì)算得到的殼聚糖含量值與實(shí)際值相差越大。將殼聚糖合成甲

殼素后進(jìn)行降解，降解成單糖接近完全，即直接降解殼聚糖得到的純度（X）乘以相應(yīng)比例

系數(shù)后為殼聚糖的實(shí)際含量。

表2殼聚糖含量測定結(jié)果

不同脫乙酰度殼聚糖（CTS）降解合成甲殼素（CT）后

比例系數(shù)Y/X

殼聚糖%百分比%（X）降解百分比%（Y）

099.899.81

82.4281.599.41.22

86.6079.899.61.25

87.6670.899.41.41

94.7362.599.81.59

98.3453.499.81.87

由于目前多數(shù)企業(yè)使用高脫乙酰