GB-T微生物高通量適應性進化測定 微流控芯片法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201X

微生物高通量適應性進化

微流控芯片法

High-throughputmicrobialadaptiveevolution

methodsbasedonmicrofluidicchip

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實施

國家市場監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國國家標準化管理委員會

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GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

微生物高通量適應性進化測定微流控芯片法

1范圍

本標準規(guī)定了微生物高通量適應性進化測定微流控芯片法的原理、試劑或材料、儀器設備、測定步

驟和結果分析。

本標準適用于大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、扭脫甲基桿菌、谷氨酸棒狀桿菌等微生物的高通量

適應性進化。

2規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

GB/T27990生物芯片基本術語。

3術語與定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

適應性進化adaptiveevolution

利用微生物繁殖迅速這一特征，在實驗室條件下通過對微生物在某一特定環(huán)境下進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，

來模擬微生物對環(huán)境的長期適應的過程。

3.2

微流控技術microfluidic

是一種在微米量級的微小通道中精確控制和操控微尺度流體的技術。

3.3

微液滴技術mircodroplets

通過加入適量表面活性劑，一種液體可以以極小的微滴的形式分散在另一與之不相溶的液體中，形

成高度分散的熱力學穩(wěn)定體系。

注：根據(jù)分散相和流動相的不同，微滴可分為兩種：W/O型即以油相為連續(xù)相、水相為分散相的油包水型微滴和與

之相對的O/W型微滴。

3.4

選擇壓力selectionpressure

指外界施與的能改變適應性進化過程前進方向的壓力，如溫度、溶劑耐受性、毒性底物等，亦稱脅

迫因子。

4原理

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在液滴微流控芯片上生成培養(yǎng)基包裹菌體的微液滴，以無菌的環(huán)境配以合適的溫度、溶氧，通過液

滴的運動往復培養(yǎng)使微生物在芯片上生長繁殖的同時維持正常的結構和功能，通過液滴分割融合的操作

單元來實現(xiàn)培養(yǎng)基的不斷補充和更換，實現(xiàn)連續(xù)傳代的目的。通過上述操作，實現(xiàn)微生物的適應性進化，

從而獲得生長速率提高，或者對特定環(huán)境獲得耐受性提高的菌株。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。

5.1水：GB/T6682二級。

5.2培養(yǎng)基

根據(jù)不同菌株的需求配置相應的培養(yǎng)基，高壓滅菌后置于4攝氏度冰箱保存?zhèn)溆茫ü腆w培養(yǎng)基在液

體的基礎上加15g/L瓊脂粉）。

5.3油相

配制含10g/LSpan?80的礦物油作為液滴生成的油相，混合均勻，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

6儀器設備

6.1分析天平：精度為0.0001g和0.01g。

6.2恒溫金屬浴加熱套：溫度范圍為4-100℃，精度為0.1℃。

6.3恒流蠕動泵：流速為1ul/min-1ml/min。

6.4光纖光譜儀：波長檢測范圍350nm-800nm。

6.5數(shù)控雕刻機：轉速24000RPM。

6.6恒溫熱壓機：60-80℃。

6.7進樣瓶3個：容量約12ml。

7測定步驟

7.1菌體準備與培養(yǎng)

7.1.1菌體準備

從凍存管中蘸取一接種環(huán)菌液涂布于固體培養(yǎng)基上活化，在菌體最適生長溫度下培養(yǎng)。

7.1.2菌體培養(yǎng)

在超凈工作臺中，酒精燈火焰附近挑取在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的單菌落放入液體培養(yǎng)基中，放入

菌體最適溫度的恒溫搖床。設置合適的轉速、溫度和培養(yǎng)時間，培養(yǎng)菌體至穩(wěn)定期。

7.2進樣瓶準備

準備三個進樣瓶，編號2、4、6號進樣瓶。2號進樣瓶用來裝菌株懸浮液，4號和6號進樣瓶用來

裝裝新鮮培養(yǎng)基和含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基。將準備好的進樣瓶清洗并在121℃，15min下高溫

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滅菌。

準備新鮮培養(yǎng)基和含不同濃度脅迫因子的培養(yǎng)基各5-10ml。準備用無菌培養(yǎng)基稀釋至2%的生長到

穩(wěn)定期的菌3-5ml，用無菌針管先向三個進樣瓶側管注入1-2ml油相。注射完畢旋轉進樣瓶，讓油相浸

濕整個進樣瓶內部，以同樣方式注入菌液約3-4mL或培養(yǎng)基6-8ml，最后注入油將進樣瓶裝滿，拔出進

樣針及其連接頭。

7.3微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片制作

芯片材料使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。使用Auto-CAD軟件作出芯片管道的結構圖，按照芯

片設計圖使用雕刻芯片管道并鉆孔，同時額外刻制一塊僅打磨平面、無管道的芯片。使用大量清水和

75%乙醇沖洗雕刻好的兩塊芯片，保證管道內無毛刺。

將兩塊芯片對齊貼合并將75%乙醇通入使之充滿管道與兩塊芯片的接觸面，使用恒溫熱壓機將芯

片在65-75°C下壓合2min。如壓合效果不理想則再次通入75%乙醇，適當提高壓合溫度和壓合時間，

重復壓合。待壓合后的芯片冷卻降溫后，使用快速粘結劑將外徑為700μm的金屬管插入芯片上的孔內

并粘接固定。待粘結劑固化后芯片即可使用（使用前需用油相在低流速下潤洗管道）。

7.4微生物連續(xù)培養(yǎng)微流控平臺的搭建

芯片C1和C3口外連兩套約1.5m長管路，為菌株主培養(yǎng)通道。C1口外長管路上設有光纖光譜儀

檢測區(qū)域，可持續(xù)在線檢測獲得液滴內菌體的OD值。C5口的管道用于補油，以控制兩相長度。C2口

外的進樣瓶用于菌株懸浮液進樣，C4和C6外的兩個進樣瓶分別裝有新鮮培養(yǎng)基和含有一定濃度脅迫

因子的培養(yǎng)基。進樣瓶選用具有頂管和側管的液壓瓶，其中頂管在液壓瓶的中心，與液壓瓶的頂部恰好

連通；側管則較靠近瓶壁，貫穿液壓瓶頂部，直達液壓瓶底部。頂管與泵連接，側管與芯片連接。CF

口連接的電磁閥控制著系統(tǒng)總出口，可排出廢液至廢液瓶。除CF口外，每個管道上都接有一個恒流蠕

動泵作為注射泵。1-6號注射泵的一端接入礦物油進樣瓶，用于平臺各管道內的油相進樣。選用具有三

通管道的注射泵，其具有三種狀態(tài)：當處于O狀態(tài)時，注射泵的注射器和礦物油進樣瓶連通，注射器

可吸取油；當處于I狀態(tài)時，注射泵的注射器和芯片連通，注射器可推出油；當處于B狀態(tài)時，芯片和

礦物油進樣瓶連通，泵對應的芯片通道口打開，通道處于通路狀態(tài)。

整個平臺可裝進一個密閉箱體，以便于控制培養(yǎng)溫度。3個進樣瓶置于恒溫金屬浴加熱套中，芯片

和管道置于恒溫金屬浴加熱套上，以便使樣品和液滴的溫度盡快到達培養(yǎng)溫度。使用空氣加熱器來控制

環(huán)境溫度，減少液滴與環(huán)境的換熱，更加準確地控制溫度。配置溫度計來讀取箱體內的溫度。

7.5液滴識別和編號

在生成液滴后，可通過油水檢測激光來識別液滴。識別的原理主要是基于油相和水相的激光折射率

之間的差異。當油相經(jīng)過芯片上的激光檢測區(qū)時，油水檢測激光將讀取到一個較低的光壓值（一般低于

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1）；當液滴經(jīng)過芯片上的激光檢測區(qū)時，油水檢測激光將讀取到一個較高的光壓值（一般高于3.2）。通

過光壓值的大小對比可識別出液滴。由于激光是連續(xù)檢測的，因此可以對液滴進行編號，并測出液滴的

長度。

7.6液滴生成

所有泵的初始狀態(tài)為O狀態(tài)且泵的注射器都吸滿油。將3號泵切換至B狀態(tài)，2號泵切換至I狀態(tài)

推出菌株懸浮液至通道交叉口處，然后將1號泵切換至I狀態(tài)推出油相，利用油相的剪切力來阻斷菌株

懸浮液（即水相）而得到油包水型的液滴。利用2號泵和1號泵交替推出水相和油相，通過控制泵推出

兩相的時間和速度，可控制液滴的長度，實現(xiàn)液滴的生成。

7.7菌體芯片培養(yǎng)和生長狀況監(jiān)測

在生成液滴后，將2號泵切換至O狀態(tài)。可定義液滴在芯片主通路中的正反向運動。正向運動指

的是3號泵處于B狀態(tài)，1號泵推出油相使液滴在主通路中定向運動；反向運動指的是1號泵處于B

狀態(tài)，3號泵推出油相使液滴在主通路中定向運動。利用1、3號泵的交替切換可以使液滴在主管道內

進行正反向的往復運動，進行液滴往復運動培養(yǎng)過程。在往復運動過程中液滴會發(fā)生一定的自旋轉運動，

以達到促進微滴內部混合的目的。液滴往復運動的單程時間和往復運動的流量均可使用蠕動泵設定。

液滴在每次定向運動過程中，都可以通過激光檢測區(qū)進行識別和編號。而液滴在每次反向運動時，可以

對液滴之間的距離進行校正。當兩個液滴之間的距離短于設定距離時，可將5號泵切換至I狀態(tài)進行補

油；當兩個液滴之間的距離長于設定距離時，可將5號泵切換至B狀態(tài)，3號泵將多余的油從C5口推

出。對液滴距離進行校正的好處在于可以防止液滴在運行過程中自行融合，維持液滴運行的穩(wěn)定性。

液滴在進行反向運動經(jīng)過光纖光譜儀檢測區(qū)域時，可進行菌體濃度的檢測。檢測區(qū)域兩端分別連接固定

有光纖光譜儀的光源光纖與接收光纖，液滴經(jīng)過檢測區(qū)域時會吸收掉部分光纖光譜儀光源發(fā)出的光，剩

余的光進入接收光纖。根據(jù)標定的空白樣品吸收光強度可計算出該液滴的吸光度數(shù)值并實時反饋到與光

纖光譜儀配套的計算機中。根據(jù)波長600nm處液滴的吸光度可折算出液滴內菌體的濃度，并以此評價

菌體的生長狀態(tài)。

7.8液滴分割和融合

在液滴進行正向運動時可進行液滴的分割和融合操作。當檢測到液滴后，1號泵將液滴推至C5補

油通道和主通道的交界處，然后將5號泵切換至I狀態(tài)，從垂直方向注入油相，利用油相剪切力可將液

滴進行分割（該過程可用PLC控制器控制油相注入的時間和速度，實現(xiàn)液滴的定量分割）。被分割開的

部分液滴可以通過打開電磁閥而被排到廢液瓶里，剩下的部分液滴可進行后續(xù)的液滴融合操作。

施加電場可以促進液滴融合。當施加特定電場時，電場會使得液滴表面的表面活性劑不穩(wěn)定，從而導致

液滴融合。在分割完液滴后，通過4或6號泵可以把新鮮培養(yǎng)基或含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基推至

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主通道處，然后給電極通電產生電場，以促進新鮮培養(yǎng)基或含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基和剩下的部

分液滴進行融合。該過程可用PLC控制器控制新鮮培養(yǎng)基和含有一定濃度脅迫因子的培養(yǎng)基的體積和

融合比例，實現(xiàn)含有不同濃度脅迫因子的培養(yǎng)基與剩余液滴的融合操作