GB-T微生物痕量基因殘留測(cè)定 微滴數(shù)字PCR法征求意見(jiàn)稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

微生物痕量基因殘留測(cè)定微滴數(shù)字PCR

法

Determinationofmicrobialconstantgeneresidues—Microdropletdigital

PCR

（征求意見(jiàn)稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布

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GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

微生物痕量基因殘留測(cè)定微滴數(shù)字PCR法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物痕量基因殘留測(cè)定微滴數(shù)字PCR法的原理、試劑或

材料、儀器設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物加工產(chǎn)品中所殘留的痕量基因測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅

注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件

3.1

微生物加工microbialprocessing

利用微生物的代謝能力對(duì)原料進(jìn)行發(fā)酵、催化、轉(zhuǎn)化等進(jìn)行加工，以改

變?cè)闲再|(zhì)的過(guò)程。

3.2

痕量基因殘留traceresidualDNA

微生物加工產(chǎn)品在后續(xù)分離純化中無(wú)法去除的微量核酸。

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GB/T××××—201×

3.3

微滴數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即將

含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不

含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，

逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴

判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始

拷貝數(shù)或濃度。

4原理

利用液滴微流控技術(shù)，基于泊松分布，將待測(cè)生物樣品所殘留的目標(biāo)核

酸PCR擴(kuò)增體系分割成幾十到幾萬(wàn)份包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子微升級(jí)

油包水液滴。由于液滴體積小，目標(biāo)核酸分子的相對(duì)濃度較高，可以按照常

規(guī)PCR體系對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)熒光探針實(shí)現(xiàn)信號(hào)讀出。所產(chǎn)生液滴陽(yáng)性信

號(hào)的數(shù)目即代表了原始樣本中目標(biāo)核酸分子的拷貝數(shù)，從而直接數(shù)出目標(biāo)核

酸分子的個(gè)數(shù)，對(duì)起始樣品的進(jìn)行絕對(duì)定量。

5試劑和材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?/p>

5.1水：GB/T6682一級(jí)。

5.2數(shù)字PCR反應(yīng)試劑盒

5.3待檢測(cè)微生物基因引物和探針。

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6儀器和設(shè)備

6.1分析天平0.1mg

6.2數(shù)字PCR儀

6.3離心機(jī)

6.4核酸測(cè)定儀

6.5渦旋振蕩儀

6.6其它相關(guān)儀器和設(shè)備

6.7不同量程的移液槍及相應(yīng)配套的吸頭

7測(cè)定步驟

7.1樣品準(zhǔn)備

將樣品溶于不同體積的去離子水，獲得目標(biāo)核酸濃度不同待測(cè)試樣。

7.2數(shù)字PCR檢測(cè)

7.3.1試樣數(shù)字PCR方法

每個(gè)試樣的數(shù)字PCR反應(yīng)都設(shè)置3個(gè)平行，并按照表1設(shè)置數(shù)字PCR的

體系。

表1數(shù)字PCR反應(yīng)體系

試劑終濃度體系

2×Supermix1×10μL

Primer-F10μmol/L1.2μL

Primer-R10μmol/L1.2μL

Primer-P10μmol/L0.4μL

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待測(cè)試樣4μL

DdH2O補(bǔ)足20μL

注：此為一般反應(yīng)體系，可根據(jù)不同市售數(shù)字PCR試劑盒進(jìn)行調(diào)整

體系配置完成后按照數(shù)字PCR儀器的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)上述20μL擴(kuò)

增進(jìn)行完全進(jìn)行分割獲得油包水液滴。

將液滴轉(zhuǎn)移96孔板，利用熱封機(jī)進(jìn)行封膜。封膜之后應(yīng)該在30min內(nèi)

進(jìn)行PCR反應(yīng)，或者放于4℃冰箱4h之內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？稍谌我庖慌_(tái)96

孔PCR儀上完成，注意升降溫速度≤2.5℃/s，擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。

表2數(shù)字PCR擴(kuò)增程序

步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)

預(yù)變性9510min1

變性9430s

40

退火/延伸601min

保持4∞

注：一般擴(kuò)增程序不變，但可根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)情況調(diào)整退火溫度

擴(kuò)增結(jié)束后讀取所有液滴的熒光信號(hào)，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

7.3.2數(shù)字PCR的對(duì)照實(shí)驗(yàn)

在試樣進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，分別設(shè)置陽(yáng)性和空白對(duì)照。

合成目標(biāo)核酸作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌雙蒸水作為空白對(duì)照。

各對(duì)照PCR反應(yīng)體系，均按照7.3.1中的數(shù)字PCR體系進(jìn)行配置。

8結(jié)果分析

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8.1閾值的設(shè)定

根據(jù)擴(kuò)增體系終點(diǎn)熒光值設(shè)置熒光的閾限值，閾限值需明確區(qū)分?jǐn)U增體

系中的陰性液滴和陽(yáng)性液滴。

8.2對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果分析

陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果中有目標(biāo)基因擴(kuò)增現(xiàn)象，空白對(duì)照中沒(méi)有任何擴(kuò)增現(xiàn)象，

表明此次數(shù)字PCR檢測(cè)正常，無(wú)需重復(fù)檢測(cè)，具有可信性。

8.3試樣檢測(cè)結(jié)果分析

按公式（1）計(jì)算：：

…………………