食品中氨基酸和蛋白質(zhì)的測定

食品中氨基酸和蛋白質(zhì)的測定第十章食品中氨基酸和蛋白質(zhì)的測定一、氨基酸的測定二、蛋白質(zhì)的測定第2頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸20種。其中必需氨基酸8種:亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。一、氨基酸的測定（一）概述第3頁,共80頁，2024年2月25日，星期天氨基酸態(tài)氮的測定甲醛滴定法電位滴定法氨基酸總量的測定茚三酮比色法氨基酸類型和含量的測定氨基酸自動分析儀第4頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（二）食品中氨基酸態(tài)氮的測定

原理：氨基酸為兩性電解質(zhì)，既含有酸性的羧基，又含有堿性的氨基，在接近中性的水溶液中，全部解離為雙極離子形成內(nèi)鹽，當(dāng)加入甲醛后，氨基與甲醛反應(yīng)，從而使其堿性消失，游離出酸性的羧基，這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液來滴定羧基，根據(jù)消耗的堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積即可計算出氨基酸態(tài)氮。1.甲醛滴定法第5頁,共80頁，2024年2月25日，星期天甲醛反應(yīng)RCHNH3+COO－HCHORCHNHCH2OHHCHORCHN(CH2OH)2羥甲基氨基酸二羥甲基氨基酸COO－COO－H+第6頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）40%中性甲醛（2）1%酚酞指示劑（3）0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（4）活性碳試劑第7頁,共80頁，2024年2月25日，星期天儀器第8頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）樣品處理：對于含水量少的固體樣品粉碎過篩，混勻，稱樣含水多的固體樣品洗凈擦干，去皮、核、柄，切成小塊于植物組織搗碎機中，加等量的水，搗成勻漿，稱勻漿液體樣品：直接吸取將樣品置于小燒杯中，加蒸餾水50mL，活性炭5g，加熱煮沸5min，期間不斷用玻璃棒攪拌，過濾，用40mL熱蒸餾水洗滌活性炭，收集濾液備用。

測定步驟第9頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（2）測定在上述濾液中加入3-4滴酚酞指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈淺紅色，而后加入中性甲醛20mL，搖勻，淺紅色消失（為什么？）。繼續(xù)用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈淺紅色，記錄自甲醛加入后所消耗的0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

（3）做空白實驗第10頁,共80頁，2024年2月25日，星期天式中：C---氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）

V---樣品溶液消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）

V0---空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）

m---樣品的質(zhì)量（g）

0.014------氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol）結(jié)果計算第11頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.該方法簡便、易行，適用于測定食品中的游離氨基酸態(tài)氮。2.若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進行測定。說明及注意事項第12頁,共80頁，2024年2月25日，星期天2.電位滴定法

原理：氨基酸為兩性電解質(zhì)，既含有羧基又含有氨基，加入甲醛后，甲醛與氨基酸的氨基作用，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，以酸度計測定終點pH=9.2

。第13頁,共80頁，2024年2月25日，星期天酸度計酸度計磁力攪拌器儀器第14頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）40％中性甲醛溶液（2）0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液

試劑第15頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

吸取含氨基酸的樣品溶液5-10mL于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20mL置于200mL燒杯中，加水60mL，插入酸度計的指示電極和參比電極，開動磁力攪拌器，用0.05mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)，供計算總酸含量。向上述溶液中加入10mL40%中性甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄自加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)。測定步驟（1）樣品處理同甲醛滴定法（2）樣液測定（3）做空白實驗第16頁,共80頁，2024年2月25日，星期天式中：C---氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L）

V---樣品溶液消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）

V0---空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）

m---樣品的質(zhì)量（g）

0.014------氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol）結(jié)果計算第17頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.此法適用于測定各類食品中的游離氨基酸。2.操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確性高。

說明及注意事項第18頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（二）氨基酸總量的測定

------茚三酮比色法

氨基酸在堿性溶液中與水合茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與氨基酸含量成正比，在波長570nm下比色，測定吸光度。脯氨酸與水合茚三酮作用生成黃色化合物，需在波長440nm下比色。

原理第19頁,共80頁，2024年2月25日，星期天還原茚三酮水合茚三酮藍(lán)紫色物質(zhì)第20頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）2%茚三酮溶液:茚三酮+SnCl2試劑（2）pH8.04磷酸緩沖液（3）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:亮氨酸第21頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.制作甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定步驟試管管號0123456氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（200μg/mL）0123456氨基酸含量（μg）020040060080010001200加蒸餾水（mL）8765432pH8.04磷酸緩沖液（mL）22222222%茚三酮溶液（mL）2222222第22頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

混勻，置于沸水浴中加熱15min，冷卻后，用水定容至50mL，靜置15min后，在波長570nm下比色，測定吸光度。以氨基酸含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第23頁,共80頁，2024年2月25日，星期天含水少的固體樣品粉碎過篩，混勻，稱取含水多的固體樣品洗凈擦干，去皮、核、柄，切成小塊于植物組織搗碎機中，加等量的水，搗成勻漿，稱勻漿液體樣品直接吸取

置于小燒杯中，加蒸餾水50mL，活性炭5g，加熱煮沸5min，期間不斷用玻璃棒攪拌，過濾，用30~40mL熱蒸餾水洗滌活性炭，收集濾液于100mL容量瓶中，定容，備用。（2）樣品處理

（3）測定

吸取樣液1~4mL于刻度試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定第24頁,共80頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果計算式中：C---待測溶液的氨基酸含量（μg）

m---樣品的質(zhì)量（g）

v1---樣品溶液總體積（mL）

v2---測定用樣品溶液的體積（mL）

第25頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.茚三酮受光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化成淡紅色或深紅色，使用前必須純化。2.茚三酮與氨基酸反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色在1h保持穩(wěn)定，故應(yīng)抓緊時間比色。3.該顯色反應(yīng)十分靈敏，故需用無氨蒸餾水。說明與注意事項方法：普通蒸餾水中加硫酸調(diào)至pH<2，使水中各種形態(tài)的氨或胺最終都變成不揮發(fā)的鹽類，用附有緩沖球的蒸餾器進行蒸餾，收集餾出液即可。

無氨蒸餾水制備第26頁,共80頁，2024年2月25日，星期天利用各種氨基酸的不同性質(zhì)，使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進行分離。洗脫下來的氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸的含量成正比。（三）氨基酸自動分析儀法原理第27頁,共80頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共80頁，2024年2月25日，星期天水解：準(zhǔn)確稱取固體樣品50~200mg，小心加入水解管中，加入6mol/LHCl10mL,酒精噴燈封管后，置烘箱中于110℃水解22-24小時。（1）樣品處理操作步驟第29頁,共80頁，2024年2月25日，星期天封管的三種方式：

液態(tài)氮冷凍后封管（注意：冷凍時不能將水解管直接置液氮中，否則容易凍裂）真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，則容易在封管過程中將軟化的玻璃抽碎）氮吹儀吹氮氣15分鐘后封管。第30頁,共80頁，2024年2月25日，星期天樣品過濾和定容：水解后的樣品取出冷卻至室溫，開管后過濾到25mL容量瓶中，水解管用去離子水洗滌3次，洗滌液過濾到容量瓶中，用去離子水洗滌濾紙，洗滌液也收集到容量瓶中。定容。脫酸：吸取樣液1-2mL，置真空脫酸儀上脫酸。溫度60℃，脫至干燥，底部留有少許固體或痕漬為止。

第31頁,共80頁，2024年2月25日，星期天脫酸后的樣品，加入1-2mL蒸餾水溶解，置振蕩混合器上混合均勻，針管吸取少量，通過0.45或0.22μm過濾器過濾后，上機分析。第32頁,共80頁，2024年2月25日，星期天自動分析儀氨基酸分離圖譜（2）樣品分析第33頁,共80頁，2024年2月25日，星期天測量峰高或用峰高乘以半峰寬確定峰面積計算出氨基酸的精確含量。根據(jù)峰出現(xiàn)的時間可以確定氨基酸的種類。第34頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（一）概述二、蛋白質(zhì)的測定（1）蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，是生物體發(fā)育及修補組織的原料，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質(zhì)。（2）人體的酸堿平衡、水平衡的維持；（3）遺傳信息的傳遞；（4）物質(zhì)的代謝及運轉(zhuǎn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。（5）人及動物需要從食品得到蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物，來構(gòu)成自身的蛋白質(zhì)，是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)；（6）衡量食品的重要營養(yǎng)指標(biāo)。1.蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用第35頁,共80頁，2024年2月25日，星期天2.

食品中的蛋白質(zhì)含量動物性食品：如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%，豬肉中為9.5%，兔肉為21%，雞肉為20%，牛乳為3.5%，黃魚為17.0%，帶魚為18.0%植物性食品：大豆為40%，稻米為8.5%，面粉為9.9%，菠菜為2.4%，黃瓜為1.0%，桃為0.8%，柑橘為0.9%，蘋果為0.4%和油菜為1.5%左右

第36頁,共80頁，2024年2月25日，星期天不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同。

一般蛋白質(zhì)平均含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。第37頁,共80頁，2024年2月25日，星期天3.蛋白質(zhì)測定方法

測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率測定蛋白質(zhì)含量；另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。

第38頁,共80頁，2024年2月25日，星期天具體測定方法凱氏定氮法：最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。快速測定法：雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)G250法、紫外吸收法第39頁,共80頁，2024年2月25日，星期天考馬斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌谝欢ǚ秶鷥?nèi)（0-1000μg/mL），顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，在波長595nm下比色，測定吸光度。此反應(yīng)十分迅速，在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，反應(yīng)非常靈敏。原理

（一）考馬斯亮藍(lán)法

第40頁,共80頁，2024年2月25日，星期天電子天平紫外-可見分光光度計儀器第41頁,共80頁，2024年2月25日，星期天試劑（1）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液

（2）考馬斯亮藍(lán)G250溶液：考馬斯亮藍(lán)G250+乙醇+磷酸第42頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

管號123456100μg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的量（mL）00.20.40.60.81蒸餾水的量（mL）10.80.60.40.20.0蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）020406080100測定步驟

分別向各試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)，蓋塞，充分混合，放置2min，于595nm下比色，測定吸光度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第43頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（2）樣品處理含水量少的固體樣品粉碎，稱取0.1000-0.2000g于離心管中，加蒸餾水10mL；含水量多的固體樣品加等量的水搗成勻漿，稱取勻漿2-5g于離心管中，加蒸餾水6mL；放置0.5-1h，以充分提取，而后離心20min，上清液轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，定容。

第44頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（3）測定吸取提取液0.1mL，分別放入10mL具塞試管中，加蒸餾水0.9mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)，蓋塞，充分混合，放置2min，于595nm下比色，測定吸光度，根據(jù)吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測液中蛋白質(zhì)含量。

（4）做空白實驗第45頁,共80頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果計算式中：C---待測溶液的氨基酸含量（μg）

m---樣品的質(zhì)量（g）

v1---樣品溶液總體積（mL）

v2---測定用樣品溶液的體積（mL）

第46頁,共80頁，2024年2月25日，星期天說明該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1000μg/mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。

第47頁,共80頁，2024年2月25日，星期天靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法；本法亦適用于豆類、油料、谷類等作物種子及肉類等樣品測定。

方法特點及應(yīng)用范圍（二）雙縮脲法

第48頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

在堿性溶液中雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)能與Cu2+生成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵也能與Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，溶液紫紅色的深淺與蛋白質(zhì)含量在一定范圍（1～10mg）內(nèi)成正比，可用分光光度計在波長540nm來測其吸光度，確定含量。原理第49頁,共80頁，2024年2月25日，星期天2H2N－C－NH2H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑1320COOHO尿素雙縮脲雙縮脲CuSO4+NaOH紫紅色物質(zhì)第50頁,共80頁，2024年2月25日，星期天電子天平紫外-可見分光光度計儀器第51頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

（1）雙縮脲試劑

:硫酸銅+酒石酸鉀鈉+NaOH試劑（2）0.05mol/L的NaOH溶液（3）5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液第52頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試劑

管號123456標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑（mL）444444蛋白質(zhì)含量（mg）01.02.03.04.05.0測定步驟

振蕩15min，室溫靜置30min，于波長540nm下比色，以蛋白質(zhì)含量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

第53頁,共80頁，2024年2月25日，星期天稱取烘干磨碎樣品約0.2000g，放入干燥的三角瓶中。然后加入5mL0.05mol/L的NaOH溶液濕潤，之后再加入20mL的雙縮脲試劑，振蕩15min，室溫靜置反應(yīng)30min，過濾。（2）樣品處理取濾液在540nm波長下比色，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)。（3）樣液測定第54頁,共80頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果計算式中：C---從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)m---樣品的質(zhì)量（g）第55頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.三角瓶一定要干燥，勿使樣品粘在瓶壁上。2.所用酪蛋白需經(jīng)凱氏定氮法確定蛋白質(zhì)的含量。3.此法簡單、快速、有較好的精確度，分析對象較廣泛，但此法準(zhǔn)確度稍低，有色物質(zhì)、還原糖、淀粉、脂類等對本法測定谷物樣品蛋白質(zhì)含量干擾較大。

說明與注意事項第56頁,共80頁，2024年2月25日，星期天凱氏定氮法是測定總有機氮量較為準(zhǔn)確的方法之一，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是一經(jīng)典分析方法，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。（三）凱氏定氮法食品中的含氮化合物大多以蛋白質(zhì)為主體，所以檢驗食品中蛋白質(zhì)時，往往測定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即可得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法可用于所有動物性、植物性食品的蛋白質(zhì)含量測定。

第57頁,共80頁，2024年2月25日，星期天因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故通常將測定結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。為什么凱氏定氮法測得的蛋白質(zhì)含量為粗蛋白含量？第58頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.常量凱氏定氮法將樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨，并與硫酸結(jié)合成硫酸銨，此過程稱為消化。加堿將消化液堿化，使氨游離出來，再通過水蒸氣蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸銨。再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。

原理第59頁,共80頁，2024年2月25日，星期天①樣品消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4→

(NH4)2SO4

＋6CO2＋12SO2

＋16H2O第60頁,共80頁，2024年2月25日，星期天濃硫酸具有脫水性，有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮濃硫酸又具有氧化性，將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO4第61頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

硫酸銅：起催化劑的作用。還有氧化汞、汞、硒粉等，但考慮到效果、價格及環(huán)境污染等多種因素，應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅。

硫酸鉀：目的是為了提高溶液的沸點，加快有機物的分解（純硫酸沸點340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。）。也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。在消化時常加入硫酸鉀、硫酸銅等催化劑第62頁,共80頁，2024年2月25日，星期天②蒸餾2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↑

＋Na2SO4＋2H2O

③吸收與滴定

2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3第63頁,共80頁，2024年2月25日，星期天適用范圍

此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定儀器①500mL凱氏燒瓶；②定氮蒸餾裝置第64頁,共80頁，2024年2月25日，星期天第65頁,共80頁，2024年2月25日，星期天（1）濃硫酸（2）硫酸銅（3）硫酸鉀

試劑（4）40%氫氧化鈉溶液

（5）4%硼酸吸收液（6）0.1mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液（7）甲基紅和溴甲酚氯混合指示劑1份0.2%的甲基紅乙醇溶液和5份0.2%溴甲酚氯乙醇溶液混合。第66頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

稱取固體樣品0.2000~2.0000g（液體樣品10~20mL，半固體樣品2~5g），小心放于500mL凱氏燒瓶中，加入研細(xì)的硫酸銅0.5g，硫酸鉀10g，濃硫酸20mL，輕輕搖勻，在凱氏瓶口蓋一小漏斗，斜放于電爐上小火加熱(在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化),待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體變?yōu)橥该鞯乃{(lán)綠色后，再繼續(xù)加熱微沸30min，冷卻。加入200mL蒸餾水，加入玻璃珠數(shù)粒。測定步驟（1）樣品消化第67頁,共80頁，2024年2月25日，星期天

將凱氏燒瓶連接好，塞緊瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面以下，接收瓶內(nèi)預(yù)先裝有50mL4%硼酸溶液和2~3滴混合指示劑，放松夾子，通過漏斗加入70~80mL40%氫氧化鈉溶液并搖動凱氏燒瓶，瓶內(nèi)溶液變?yōu)樯钏{(lán)色，或產(chǎn)生黑色沉淀，再從漏斗加入100mL蒸餾水，夾緊夾子，加熱蒸餾，至氨全部蒸出（餾出液約為250mL），將冷凝管下端提離液面，用蒸餾水沖洗管口，繼續(xù)蒸餾1min，用表面皿接幾滴溜出液，用奈氏試劑檢查，如無紅棕色物質(zhì)生成，表示蒸餾完畢。

（2）蒸餾、吸收第68頁,共80頁，2024年2月25日，星期天將上述吸收液用0.1mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)樽霞t色即為滴定終點，記錄消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。（3）滴定（4）做空白實驗第69頁,共80頁，2024年2月25日，星期天式中:

c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mol/L)V0—空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量(mL)V1—試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量(mL)m—樣品質(zhì)量(g)0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol)

6.25—蛋白質(zhì)換算系數(shù)。結(jié)果計算第70頁,共80頁，2024年2月25日，星期天1.所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。2.消化時不要用強火，注意不斷轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化完全。3.樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應(yīng)用小火加熱，并不斷搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。說明及注意事項第71頁,共80頁，2024年2月25日，星期天4.當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2~3mL后再繼續(xù)加熱消化。5.若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量。6.一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時，需適當(dāng)延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。第72頁,共80頁，2024年2月25日，星期天7.蒸餾裝置不能漏氣。8.蒸餾前若加堿