免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)Immunolabelingtechnique2021/3/29星期一1

第一節(jié)免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)2021/3/29星期一2

免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫免疫標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)記物與免疫活性物質(zhì)的聯(lián)接技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)：以標(biāo)記免疫物質(zhì)檢測(cè)相應(yīng)靶物質(zhì)的技術(shù)2021/3/29星期一3免疫標(biāo)記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性免疫標(biāo)記技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)酶熒光素同位素其它2021/3/29星期一4常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別標(biāo)記物用途熒光素FITC、RB200、TRITC免疫組化鑭系元素螯合物免疫分析測(cè)定放射性核素

3H、14C、32P、57Gr免疫分析測(cè)定

125I、131I酶HRP、AP免疫組化免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物L(fēng)uminol、lucigenin免疫分析測(cè)定金屬顆粒膠體金、鐵蛋白免疫組化免疫分析測(cè)定

2021/3/29星期一5

第二節(jié)標(biāo)記免疫技術(shù)的分類一、按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型二、按測(cè)定方式劃分的類型三、按測(cè)定用途劃分的類型2021/3/29星期一61、酶免疫技術(shù)2、熒光免疫技術(shù)3、放射免疫技術(shù)4、金免疫技術(shù)按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型2021/3/29星期一71、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按測(cè)定方式劃分的類型2021/3/29星期一8均相型（homogenous）非均相型（heterogeneous）2021/3/29星期一91、免疫測(cè)定技術(shù)2、免疫組化技術(shù)按測(cè)定用途劃分的類型2021/3/29星期一10

第三節(jié)酶標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與鑒定2021/3/29星期一11常用標(biāo)記方法1、常用酶辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）2、標(biāo)記方法戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法2021/3/29星期一12戊二醛交聯(lián)法(一步法）抗體-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶2021/3/29星期一13戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗體-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶2021/3/29星期一14過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)2021/3/29星期一15標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離酶方法：鹽析、柱層析2、鑒定抗體活性酶活性標(biāo)記物純度2021/3/29星期一16

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)enzymelinkedimmunosorbentassay

（ELISA）2021/3/29星期一17ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過程2021/3/29星期一18ELISA技術(shù)的原理與方法間接法

夾心法

競(jìng)爭(zhēng)法2021/3/29星期一19間接法2021/3/29星期一20夾心法2021/3/29星期一21競(jìng)爭(zhēng)法2021/3/29星期一22

第四節(jié)熒光標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化2021/3/29星期一23常用標(biāo)記方法1、熒光素的概念2、生物標(biāo)記熒光素的要求3、常用熒光素標(biāo)記原理與方法2021/3/29星期一24生物標(biāo)記熒光素的要求1、具有與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質(zhì)形成鮮明對(duì)比4、不影響蛋白質(zhì)的生物、免疫活性5、標(biāo)記方法安全、簡(jiǎn)便6、標(biāo)記物穩(wěn)定，易保存2021/3/29星期一25熒光抗體技術(shù)的原理與方法直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法

2021/3/29星期一26直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法2021/3/29星期一27標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離熒光素方法：柱層析2、鑒定抗體活性標(biāo)記物結(jié)合度

F/P比值的應(yīng)用意義2021/3/29星期一28

第五節(jié)放射性核素標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化2021/3/29星期一29直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I4。C125I氯胺T2021/3/29星期一30間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2HOO=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP2021/3/29星期一31結(jié)合相游離相放射免疫分析法的原理與方法2021/3/29星期一32常用標(biāo)記方法1、常用放射性核素2、125I的標(biāo)記方法直接法（氯胺T法）間接法（連接法）2021/3/29星期一33標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離目的：去除游離放射性核素方法：柱層析2、鑒定游離放射性核素含量免疫活性比放射性（mCi/mg）應(yīng)用意義2021/3/29星期一34第六節(jié)膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)(金標(biāo)法)

膠體金是由氯化金與還原劑反應(yīng)形成的一種膠體顆粒，具有吸附蛋白質(zhì)的特性(可以標(biāo)記Ag或Ab)；

膠體金顆粒具有呈色性，中等大小的膠體金顆粒呈現(xiàn)酒紅色。

膠體金標(biāo)記免疫技術(shù)是將金顆粒光學(xué)檢測(cè)的靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。2021/3/29星期一35膠體金免疫法與RIA、ELISA等方法相比,有許多優(yōu)點(diǎn)：1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和顯色劑，使操作更簡(jiǎn)便;2.膠體金法無(wú)污染，不含危害操作者即污染環(huán)境;3.膠體金標(biāo)抗體在凍干狀態(tài)下室溫儲(chǔ)存較穩(wěn)定,有效期長(zhǎng);4.靈敏度高。2021/3/29星期一36免疫標(biāo)記技術(shù)的比較FIAELISARIA敏感性較低高高特異性