DB32T3681-2019小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群分子分型技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.01

B16

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3681—2019

小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群分子分型技術(shù)

規(guī)范

Technicalspecificationformoleculartypingoftoxin-producingfusariumspeciesin

wheat

2019-12-03發(fā)布2019-12-25實(shí)施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3681—2019

小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群分子分型技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群以及產(chǎn)毒素化學(xué)型區(qū)分中鐮刀菌DNA的提取、PCR擴(kuò)增、電泳

檢測及結(jié)果判定方法和操作規(guī)范。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于產(chǎn)毒鐮刀菌種群及產(chǎn)毒化學(xué)類型的定性PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4789.15食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3原理

產(chǎn)毒鐮刀菌經(jīng)過提取DNA后，利用特異性區(qū)分引物，通過普通PCR判斷該樣品是否為禾谷鐮刀

菌或亞洲鐮刀菌。根據(jù)關(guān)鍵特異基因Tri11來區(qū)分該樣品是否產(chǎn)生3ADON、15ADON或者雪腐鐮刀烯

醇NIV化學(xué)型。

4試劑和材料

4.1水：應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。

4.2PDA培養(yǎng)基：按GB4789.15規(guī)定。

4.3CTAB緩沖液:55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化鈉（NaCl）、20mmol/LEDTA、100mmol/L

Tris-HCl（pH8.0），121℃高壓滅菌20min，儲存于2℃～8℃。

4.4TE緩沖液。

4.5RNA酶溶液（5μg/μL）。

4.6蛋白酶K（20mg/mL）。

4.7Tri飽和酚。

4.8酚：三氯甲烷：異丙醇（25：24：1）；三氯甲烷：異戊醇（24：1）。

4.9異丙醇。

4.10區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌引物

Fg16F:5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′

Fg16R:5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′

預(yù)期亞洲鐮刀菌擴(kuò)增片段大小為497bp；預(yù)期禾谷鐮刀菌擴(kuò)增片段大小為410bp。

4.11區(qū)分3A-DON、5A-DON和NIV化學(xué)型引物

1

DB32/T3681—2019

Tri11-CON:5′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′

Tri11-3ADON:5′-TCCTCATGCTCGGTGGACTCG-3′

Tri11-15ADON:5′-TGGTCCAGTTGTCCGTATT-3′

Tri11-NIV:5′-GTAGGTTCCATTGCTTGTTC-3′

預(yù)期產(chǎn)3ADON毒素類型擴(kuò)增片段大小為334bp；產(chǎn)15ADON毒素類型擴(kuò)增片段大小為279bp；產(chǎn)NIV

毒素類型擴(kuò)增片段大小為497bp。

4.12無水乙醇。

4.13DNALadder：可以清楚區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段。

4.14dNTPs混合溶液：將濃度為10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種脫氧核糖核苷酸溶液

等體積混合。

4.15TaqDNA聚合酶、PCR擴(kuò)增緩沖液及25mmol/L氯化鎂溶液。

4.1650×TAE緩沖液：稱取484gTris，量取114mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定

容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用時用水稀釋成1×TAE電泳緩沖液（工作液）。

4.17加樣緩沖液。

4.18瓊脂糖。

4.19溴化乙錠。

5主要儀器和設(shè)備

5.1天平：感量0.1g和0.1mg。

5.2PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s，孔間溫度差異<1.0℃。

5.2電泳槽、電泳儀等電泳裝置。

5.3紫外透射儀。

5.4凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。

5.5高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。

5.6培養(yǎng)箱。

6檢測

6.1樣品制備與培養(yǎng)

參照GB4789.15對樣品進(jìn)行稀釋與培養(yǎng)。

6.2DNA提取

從培養(yǎng)平皿上刮取菌絲0.2g~0.5g于1.5mL滅菌離心管中，加入少許石英砂用細(xì)玻璃棒充分碾碎

菌絲，加入500μLCTAB、40μL蛋白酶K，震蕩均勻，65°C水浴30min；加入500μL酚：三氯甲烷：

異戊醇（25：24：1），強(qiáng)烈震蕩，12000r/min離心15min；吸取上層水相至1.5mL離心管中，加入等

體積的異丙醇，震蕩混勻，12000r/min離心15min；棄上清液，用預(yù)熱至65°CTE緩沖液溶解DNA（TE

量視DNA沉淀的多少而定）；加入5μLRNA酶溶液，37°C水浴30min；加入200μL三氯甲烷：異

戊醇（24：1），強(qiáng)烈震蕩，12000r/min離心15min；吸取上層水相至新的1.5mL離心管中，加入等體

積的異丙醇，震蕩均勻，12000r/min離心10min；棄上清液，加入1mL70%冰乙醇洗滌沉淀DNA，

12000r/min離心10min；棄上清液，無菌條件下自然干燥，加預(yù)熱至65°CTE緩沖液溶解DNA（如不

能及時檢驗(yàn)，可將提取液于-20°C保存）

2

DB32/T3681—2019

也可使用等效的真菌基因組DNA提取試劑盒。

6.3PCR檢測

6.3.1區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌檢測

6.3.1.1PCR反應(yīng)體系

在PCR管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的、等效的定性PCR試劑盒配制反

應(yīng)體系。

表1PCR檢測反應(yīng)體系

試劑終濃度體積

水—

10×PCR緩沖液1×2.5μL

25mmol/L氯化鎂溶液1.5mmol/L1.5μL

dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.2mmol/L2.0μL

10μmol/LFg16F0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LFg16R0.3μmol/L0.75μL

TaqDNA聚合酶0.025U/μL—

25mg/LDNA模板2mg/L2.0μL

總體積25.0μL

“—”表示體積不確定，如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，根據(jù)TaqDNA聚合酶的濃度確定其

體積，并相應(yīng)調(diào)整水的體積，使反應(yīng)體系總體積達(dá)到25.0μL。

6.3.1.2PCR反應(yīng)程序

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35次循

環(huán)；72℃延伸10min。

不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。

6.3.1.3PCR結(jié)果檢測

用電泳緩沖液（1×TAE）制備2%瓊脂糖凝膠（55℃~60℃時加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/ml，

也可在電泳后進(jìn)行染色）。取8μL~15μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2μL上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA

Ladder作參照，9v/cm恒壓電泳，電泳40min~60min，電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀

上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)增條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。

在樣品PCR擴(kuò)增的同時，應(yīng)設(shè)置PCR陰性對照、PCR陽性對照和PCR空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

6.3.23ADON、15ADON和NIV化學(xué)型檢測

6.3.2.1PCR反應(yīng)體系

在PCR管中按表2依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的、等效的定性PCR試劑盒配制反應(yīng)體

系。

3

DB32/T3681—2019

表2PCR檢測反應(yīng)體系

試劑終濃度體積

水—

10×PCR緩沖液1×2.5μL

25mmol/L氯化鎂溶液1.5mmol/L1.5μL

dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.2mmol/L2.0μL

10μmol/LTri11-CON0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LTri11-3ADON0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LTri11-15ADON0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LTri11-NIV0.3μmol/L0.75μL

TaqDNA聚合酶0.025U/μL—

25mg/LDNA模板2mg/L2.0μL

總體積10μmol/L25.0μL

“—”表示體積不確定，如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，根據(jù)TaqDNA聚合酶的濃度

確定其體積，并相應(yīng)調(diào)整水的體積，使反應(yīng)體系總體積達(dá)到25.0μL。

6.3.2.2PCR反應(yīng)程序

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35次循

環(huán)；72℃延伸10min。

不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。

6.3.2.3PCR結(jié)果檢測

用電泳緩沖液（1×TAE）制備2%瓊脂糖凝膠（55℃~60℃時加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/mL，

也可在電泳后進(jìn)行染色）。取8μL~15μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2μL上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA

Ladder作參照，9v/cm恒壓電泳，電泳40min~60min，電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀

上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)增條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。

在樣品PCR擴(kuò)增的同時，應(yīng)設(shè)置PCR陰性對照、PCR陽性對照和PCR空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

7判定

7.1區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌判定

7.1.1樣品中擴(kuò)增出預(yù)期497bp條帶，則表示樣品是亞洲鐮刀菌；樣品未擴(kuò)增出預(yù)期497bp條帶，則表

示樣品不是亞洲鐮刀菌；

7.1.2樣品中擴(kuò)增出預(yù)期410bp條帶，則表示樣品是禾谷鐮刀菌；樣品未擴(kuò)增出預(yù)期410bp條帶，則表

示樣品不是禾谷鐮刀菌。

7.23ADON、5ADON和NIV化學(xué)型判定

7.2.1樣品中擴(kuò)增出預(yù)期334bp條帶，表示樣品產(chǎn)3ADON；樣品未擴(kuò)增出預(yù)期334bp的條帶，則表示

樣品不產(chǎn)3ADON；

7.2.2樣品中擴(kuò)增出預(yù)期279bp條帶，表示樣品產(chǎn)15ADON；樣品未擴(kuò)增出預(yù)期279bp的條帶，則表

示樣品不產(chǎn)15ADON；

7.2.3樣品中擴(kuò)增出預(yù)期497bp條帶，表示樣品產(chǎn)NIV；樣品未擴(kuò)增出預(yù)期497bp的條帶，則表示樣品

不產(chǎn)NIV。

4

DB32/T3681—2019

8質(zhì)量控制

陽性對照PCR中擴(kuò)增片段大小與預(yù)期片段大小一致，而陰性對照、空白對照PCR中沒有預(yù)期擴(kuò)增

片段，表明PCR檢測反應(yīng)體系正常工作。否則，重新檢測。

___________________________

5

DB32/T3681—2019

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：邢宇俊、仇劍波、董飛、徐劍宏、史建榮、吳季榮、陸丹丹。

I

DB32/T3681—2019

小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群分子分型技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小麥產(chǎn)毒鐮刀菌種群以及產(chǎn)毒素化學(xué)型區(qū)分中鐮刀菌DNA的提取、PCR擴(kuò)增、電泳

檢測及結(jié)果判定方法和操作規(guī)范。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于產(chǎn)毒鐮刀菌種群及產(chǎn)毒化學(xué)類型的定性PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4789.15食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3原理

產(chǎn)毒鐮刀菌經(jīng)過提取DNA后，利用特異性區(qū)分引物，通過普通PCR判斷該樣品是否為禾谷鐮刀

菌或亞洲鐮刀菌。根據(jù)關(guān)鍵特異基因Tri11來區(qū)分該樣品是否產(chǎn)生3ADON、15ADON或者雪腐鐮刀烯

醇NIV化學(xué)型。

4試劑和材料

4.1水：應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。

4.2PDA培養(yǎng)基：按GB4789.15規(guī)定。

4.3CTAB緩沖液:55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化鈉（NaCl）、20mmol/LEDTA、100mmol/L

Tris-HCl（pH8.0），121℃高壓滅菌20min，儲存于2℃～8℃。

4.4TE緩沖液。

4.5RNA酶溶液（5μg/μL）。

4.6蛋白酶K（20mg/mL）。

4.7Tri飽和酚。

4.8酚：三氯甲烷：異丙醇（25：24：1）；三氯甲烷：異戊醇（24：1）。

4.9異丙醇。

4.10區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌引物

Fg16F:5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′

Fg16R:5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′

預(yù)期亞洲鐮刀菌擴(kuò)增片段大小為497bp；預(yù)期禾谷鐮刀菌擴(kuò)增片段大小為410bp。

4.11區(qū)分3A-DON、5A-DON和NIV化學(xué)型引物

1

DB32/T3681—2019

Tri11-CON:5′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′

Tri11-3ADON:5′-TCCTCATGCTCGGTGGACTCG-3′

Tri11-15ADON:5′-TGGTCCAGTTGTCCGTATT-3′

Tri11-NIV:5′-GTAGGTTCCATTGCTTGTTC-3′

預(yù)期產(chǎn)3ADON毒素類型擴(kuò)增片段大小為334bp；產(chǎn)15ADON毒素類型擴(kuò)增片段大小為279bp；產(chǎn)NIV

毒素類型擴(kuò)增片段大小為497bp。

4.12無水乙醇。

4.13DNALadder：可以清楚區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段。

4.14dNTPs混合溶液：將濃度為10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種脫氧核糖核苷酸溶液

等體積混合。

4.15TaqDNA聚合酶、PCR擴(kuò)增緩沖液及25mmol/L氯化鎂溶液。

4.1650×TAE緩沖液：稱取484gTris，量取114mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定

容至2L。分裝后高壓滅菌備用。使用時用水稀釋成1×TAE電泳緩沖液（工作液）。

4.17加樣緩沖液。

4.18瓊脂糖。

4.19溴化乙錠。

5主要儀器和設(shè)備

5.1天平：感量0.1g和0.1mg。

5.2PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s，孔間溫度差異<1.0℃。

5.2電泳槽、電泳儀等電泳裝置。

5.3紫外透射儀。

5.4凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。

5.5高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。

5.6培養(yǎng)箱。

6檢測

6.1樣品制備與培養(yǎng)

參照GB4789.15對樣品進(jìn)行稀釋與培養(yǎng)。

6.2DNA提取

從培養(yǎng)平皿上刮取菌絲0.2g~0.5g于1.5mL滅菌離心管中，加入少許石英砂用細(xì)玻璃棒充分碾碎

菌絲，加入500μLCTAB、40μL蛋白酶K，震蕩均勻，65°C水浴30min；加入500μL酚：三氯甲烷：

異戊醇（25：24：1），強(qiáng)烈震蕩，12000r/min離心15min；吸取上層水相至1.5mL離心管中，加入等

體積的異丙醇，震蕩混勻，12000r/min離心15min；棄上清液，用預(yù)熱至65°CTE緩沖液溶解DNA（TE

量視DNA沉淀的多少而定）；加入5μLRNA酶溶液，37°C水浴30min；加入200μL三氯甲烷：異

戊醇（24：1），強(qiáng)烈震蕩，12000r/min離心15min；吸取上層水相至新的1.5mL離心管中，加入等體

積的異丙醇，震蕩均勻，12000r/min離心10min；棄上清液，加入1mL70%冰乙醇洗滌沉淀DNA，

12000r/min離心10min；棄上清液，無菌條件下自然干燥，加預(yù)熱至65°CTE緩沖液溶解DNA（如不

能及時檢驗(yàn)，可將提取液于-20°C保存）

2

DB32/T3681—2019

也可使用等效的真菌基因組DNA提取試劑盒。

6.3PCR檢測

6.3.1區(qū)分禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌檢測

6.3.1.1PCR反應(yīng)體系

在PCR管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的、等效的定性PCR試劑盒配制反

應(yīng)體系。

表1PCR檢測反應(yīng)體系

試劑終濃度體積

水—

10×PCR緩沖液1×2.5μL

25mmol/L氯化鎂溶液1.5mmol/L1.5μL

dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.2mmol/L2.0μL

10μmol/LFg16F0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LFg16R0.3μmol/L0.75μL

TaqDNA聚合酶0.025U/μL—

25mg/LDNA模板2mg/L2.0μL

總體積25.0μL

“—”表示體積不確定，如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，根據(jù)TaqDNA聚合酶的濃度確定其

體積，并相應(yīng)調(diào)整水的體積，使反應(yīng)體系總體積達(dá)到25.0μL。

6.3.1.2PCR反應(yīng)程序

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35次循

環(huán)；72℃延伸10min。

不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。

6.3.1.3PCR結(jié)果檢測

用電泳緩沖液（1×TAE）制備2%瓊脂糖凝膠（55℃~60℃時加入溴化乙錠至終濃度為0.5μg/ml，

也可在電泳后進(jìn)行染色）。取8μL~15μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2μL上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA

Ladder作參照，9v/cm恒壓電泳，電泳40min~60min，電泳結(jié)束后，置于凝膠成像儀上或紫外透射儀

上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)增條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。

在樣品PCR擴(kuò)增的同時，應(yīng)設(shè)置PCR陰性對照、PCR陽性對照和PCR空白對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

6.3.23ADON、15ADON和NIV化學(xué)型檢測

6.3.2.1PCR反應(yīng)體系

在PCR管中按表2依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗(yàn)證的、等效的定性PCR試劑盒配制反應(yīng)體

系。

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DB32/T3681—2019

表2PCR檢測反應(yīng)體系

試劑終濃度體積

水—

10×PCR緩沖液1×2.5μL

25mmol/L氯化鎂溶液1.5mmol/L1.5μL

dNTPs混合溶液（各2.5mmol/L）各0.2mmol/L2.0μL

10μmol/LTri11-CON0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LTri11-3ADON0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LTri11-15ADON0.3μmol/L0.75μL

10μmol/LTri11-NIV0.3μmol/L0.75μL

TaqDNA聚合酶0.025U/μL—

25mg/LDNA模板2mg/L2.0μL

總體積10μmol/L25.0μL

“—”表示體積不確定，如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液，根據(jù)TaqDNA聚合酶的濃度

確