(2.11)-4.2chapter4(2)酶工程酶工程酶工程

1第四章酶的提取分離純化酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，而獲得所要求的酶制品的技術(shù)過(guò)程。主要包括細(xì)胞破碎、提取、離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結(jié)晶等。2第四章酶的提取分離純化機(jī)械破碎物理破碎化學(xué)破碎酶解破碎酸溶液提取堿溶液提取鹽溶液提取有機(jī)溶劑提取沉淀分離、離心分離膜分離、層析分離電泳分離、萃取分離結(jié)晶、干燥濃縮3第五節(jié).過(guò)濾與膜分離

過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過(guò)程。根據(jù)截留物質(zhì)顆粒大小不同，過(guò)濾可以分為粗濾、微濾、超濾和反滲透。類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm（1*103-5*105）病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜超濾45.1非膜過(guò)濾：采用高分子膜外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì),包括粗濾和微濾。第五節(jié).過(guò)濾與膜分離

根據(jù)過(guò)濾介質(zhì)的不同，可將過(guò)濾分為非膜過(guò)濾和膜過(guò)濾。55.2膜過(guò)濾：借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。第五節(jié).過(guò)濾與膜分離

膜分離壓力差膜分離微濾（MF）超濾（UF）反滲透（RO）電場(chǎng)膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴(kuò)散膜分離透析65.2膜過(guò)濾：借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。第五節(jié).過(guò)濾與膜分離

在酶的分離純化過(guò)程中，通過(guò)微濾除去酶液中含有的微生物細(xì)胞等。超濾技術(shù)不僅用于酶的分離純化，同時(shí)還能達(dá)到酶的分離濃縮的目的，特別適用于液體酶制劑的生產(chǎn)。1.對(duì)酶的活性無(wú)損害，常溫常壓下即可進(jìn)行；2.操作簡(jiǎn)單，能耗低，節(jié)約資源，保護(hù)環(huán)境；類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過(guò)濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm（1*103-5*105）病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜7討論：如果你漂流在大海上，周圍的水資源只有海水，如何獲得飲用水？8在高濃度水溶液一側(cè)加壓，使其與低濃度水溶液側(cè)的壓差大于滲透壓，則高濃度水溶液中的水將通過(guò)半透膜流向低濃度水溶液側(cè)，這一過(guò)程稱為反滲透。5.2膜分離-反滲透（RO）9細(xì)菌、病毒酶、蛋白質(zhì)aa、糖、二價(jià)鹽、維生素游離酸、單價(jià)鹽水微濾反滲透超濾納濾101、海水淡化2、純凈水生產(chǎn)3、污水處理知識(shí)擴(kuò)展：膜分離的具體應(yīng)用舉例膜分離的具體應(yīng)用舉例——海水淡化112015年7月，三沙市西沙洲，工作人員調(diào)試海水淡化設(shè)備。2014年1月，三沙市鴨公島居民用上了海水淡化水12凈水器凈水器功能可有效濾除水中的鐵銹、砂石及直徑大于5μm的雜質(zhì);可有效去除水中的細(xì)菌、毒素。膜分離的具體應(yīng)用舉例——凈水器酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，而獲得所要求的酶制品的技術(shù)過(guò)程。主要包括細(xì)胞破碎、提取、離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結(jié)晶等。13第四章酶的提取分離純化機(jī)械破碎物理破碎化學(xué)破碎酶解破碎酸溶液提取堿溶液提取鹽溶液提取有機(jī)溶劑提取沉淀分離、離心分離膜分離、層析分離電泳分離、萃取分離結(jié)晶、干燥濃縮14第六節(jié).層析分離利用混合物中個(gè)組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子特性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達(dá)到分離的目的。流動(dòng)相固定相15第六節(jié).層析分離總論16第六節(jié).層析分離總論1.色譜柱的準(zhǔn)備2.固定相的制備3.裝柱4.平衡5.上樣6.洗脫7.收集洗脫液8.洗脫液分析9.柱的再生10.下一輪上樣玻璃色譜柱硅膠凝膠顆粒17

層析方法原理吸附層析吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附力不同分配層析各組分在兩相中的分配系數(shù)不同離子交換層析離子交換劑上的活性基團(tuán)對(duì)各離子的親和力不同凝膠層析各組分相對(duì)分子量不同親和層析分子與配基間專一又可逆的親和力層析聚焦將兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析相結(jié)合第六節(jié).層析分離總論6.1吸附層析18吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附劑來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。吸附層析是各種層析中最早應(yīng)用的技術(shù)。196.1.1吸附層析的原理活性炭吸附劑一般是多孔的固體，固體內(nèi)部分子力是對(duì)稱的，而固體表面的分子受力不對(duì)稱，向內(nèi)一面受到固體內(nèi)部分子的作用力，就會(huì)被吸附到固體表面上。吸附劑選擇：通常用于酶的分離純化的吸附劑有硅藻土、氧化鋁、磷酸鈣、羥基磷灰石和活性炭等。206.1.2吸附劑與洗脫劑的選擇硅藻土硅膠活性炭洗脫劑選擇原則：1、不會(huì)與吸附劑作用，不會(huì)使吸附劑溶解2、對(duì)混合液各組分溶解度大，粘度小，流動(dòng)性好，容易與

被洗脫組分分離3、有一定純度，以免雜質(zhì)對(duì)分離帶來(lái)不利影響216.1.2吸附劑與洗脫劑的選擇常用的洗脫劑有石油醚、四氯化碳甲苯、乙醚、氯仿、丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑。6.1.3吸附層析的操作22吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。236.2分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。固定相、流動(dòng)相、展開(kāi)劑、溶劑.Eg：紙層析。紙層析246.2分配層析薄層層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。固定相、流動(dòng)相、展開(kāi)劑、溶劑.Eg:薄層層析（TLC）底物產(chǎn)物256.3離子交換層析結(jié)合洗脫離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。26母體6.3.1陽(yáng)離子交換劑與陰離子交換劑常用的母體有纖維素、樹(shù)脂、凝膠。常用的活化基團(tuán)有酸性基團(tuán)如磺酸基、磷酸基;

堿性基團(tuán)如季銨、DEAE等?；罨鶊F(tuán)27按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，可分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。6.3.1陽(yáng)離子交換劑與陰離子交換劑+++離子交換劑和它們所吸引的電荷---陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑若活性基團(tuán)帶負(fù)電荷，則能吸引帶正電荷的例子，稱為陽(yáng)離子交換劑。若活性基團(tuán)帶正電荷，則能吸引帶負(fù)電荷的離子，稱為陰離子交換劑。28母體常用的陽(yáng)離子交換劑有羧甲基CM-纖維素,磷酸基PO3-,磺酸基SO3-常用陰離子交換劑：DEAE-Sephadex（二乙胺基乙基-葡聚糖凝膠）6.3.1陽(yáng)離子交換劑與陰離子交換劑活化基團(tuán)29由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。調(diào)節(jié)溶液pH環(huán)境就可以實(shí)現(xiàn)。思考：純化酶分子用哪種離子交換劑呢？6.3.1陽(yáng)離子交換劑與陰離子交換劑306.3.2離子交換層析流程離子交換層析操作流程裝柱：干法裝柱、濕法裝柱平衡：緩沖液上柱：流速洗脫：洗脫液、梯度洗脫再生：緩沖液（酸堿溶液）316.3.2離子交換層析流程裝柱平衡上柱洗脫再生緩沖液離子待分離樣品1待分離樣品2326.3離子交換層析裝柱平衡上柱洗脫再生洗脫液1洗脫液233裝柱平衡上柱洗脫再生6.3.2離子交換層析流程緩沖液離子洗脫液1洗脫液2346.3.3離子交換層析結(jié)果分析陰離子交換層析原理示意圖上柱吸附洗脫35凝膠層析又稱分子篩層析，凝膠過(guò)濾或分子排阻層析，是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。常用凝膠：葡聚糖（Sephadex）、瓊脂糖(Sepharose)

、聚丙烯酰胺（PAGE）。6.4凝膠層析多孔凝膠電鏡圖示36凝膠層析最先洗脫下來(lái)的是小分子還是大分子？6.4.1凝膠層析分離原理1、在凝膠層析的洗脫過(guò)程中，（）A、分子質(zhì)量最大的分子最先流出B、分子質(zhì)量最小的分子最先流出C、蛋白質(zhì)分子最先流出D、鹽分子最先流出376.4.1凝膠層析分離原理c當(dāng)混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。386.5親和層析利用生物分子與配體之間所具有的專一而又可逆的親和力使生物分子分離純化的技術(shù)。常用瓊脂糖凝膠作為母體。39載體配體臂待分離組分親和吸附洗脫再生雜蛋白目的酶6.5.1親和層析流程圖配基固相化洗脫劑406.5.1親和層析流程圖41思考：如果我們要分離一種酶分子，那么可以利用什么作為配體？42分離產(chǎn)物相應(yīng)的配基酶抗體凝集素激素底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗原、病毒、細(xì)胞多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體受體、載體蛋白6.5.2親和層析的應(yīng)用親和層析分離可保持蛋白活性，分離特異性高，在酶的分離純化中有重要應(yīng)用。43

層析方法原理吸附層析吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附力不同分配層析各組分在兩相中的分配系數(shù)不同離子交換層析離子交換劑上的活性基團(tuán)對(duì)各離子的親和力不同凝膠層析各組分相對(duì)分子量不同親和層析分子與配基間專一又可逆的親和力第六節(jié).層析分離小結(jié)44第六節(jié).層析分離小結(jié)根據(jù)樣品混合液的成分，如果雜質(zhì)較多，先用

；若樣品溶解度差別很大，可以用

；若樣品混合液中成分都帶有電荷或目的酶與雜蛋白等電點(diǎn)顯著不同的可以用

；若分子量大小顯著不同可以用

，若目的蛋白與某特殊物質(zhì)的專一性很強(qiáng)可用

。

吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，而獲得所要求的酶制品的技術(shù)過(guò)程。主要包括細(xì)胞破碎、提取、離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結(jié)晶等。45第四章酶的提取分離純化機(jī)械破碎物理破碎化學(xué)破碎酶解破碎酸溶液提取堿溶液提取鹽溶液提取有機(jī)溶劑提取沉淀分離、離心分離膜分離、層析分離電泳分離、萃取分離結(jié)晶、干燥濃縮46第七節(jié)電泳分離帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過(guò)程稱為電泳。不同物質(zhì)由于其帶電性質(zhì)不同及其顆粒大小不同，在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向和速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。紙電泳薄層電泳凝膠電泳等電點(diǎn)聚焦電泳顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。47第七節(jié)

電泳分離電泳分離的時(shí)候，移動(dòng)速度最快是大分子還是小分子？電泳中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后?；旌蠘悠穾Э啄z

小分子大分子7.1凝膠電泳原理凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)，常用聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠。49等電聚焦電泳(