HJ 775-2015 水質(zhì) 蛔蟲(chóng)卵的測(cè)定 沉淀集卵法（正式版）

中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)水質(zhì)蛔蟲(chóng)卵的測(cè)定沉淀集卵法 2015-12-04發(fā)布 1 3方法原理 14試劑和材料 5儀器和設(shè)備 6樣品 27分析步驟 2 39精密度 310質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 4 4 4附錄A(資料性附錄)硝酸鈉水中溶解度、離心機(jī)離心力及轉(zhuǎn)速計(jì)算公式 5附錄B(資料性附錄)蛔蟲(chóng)卵的鑒定 6附錄C(資料性附錄)蛔蟲(chóng)卵配制樣品的制備 8為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國(guó)水污染防治法》,保護(hù)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中蛔蟲(chóng)卵的測(cè)定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了地表水和廢水中蛔蟲(chóng)卵測(cè)定的沉淀集卵法。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A～附錄C為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由環(huán)境保護(hù)部科技標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：常州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心。本標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證單位：上海市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、浙江省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、蘇州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、徐州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站和泰州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站。本標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境保護(hù)部2015年12月4日批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)自2016年1月1日起實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由環(huán)境保護(hù)部解釋。1水質(zhì)蛔蟲(chóng)卵的測(cè)定沉淀集卵法1適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中蛔蟲(chóng)卵的沉淀集卵法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水和廢水中蛔蟲(chóng)卵的測(cè)定。當(dāng)取樣體積為10L時(shí)，本方法的檢出限為5個(gè)/10L。2規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范3方法原理沉淀集卵法主要通過(guò)樣品濃縮、雜質(zhì)分離、鏡檢計(jì)數(shù)等環(huán)節(jié)對(duì)水中蛔蟲(chóng)卵進(jìn)行測(cè)定。用60目篩網(wǎng)過(guò)濾去除樣品中較大的雜質(zhì)，利用蛔蟲(chóng)卵比重大于水和易于沉淀的特性過(guò)夜沉淀濃縮水樣，用虹吸的方法棄去上清液，用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉(zhuǎn)移時(shí)的清洗劑，進(jìn)一步離心濃縮轉(zhuǎn)移的剩余物，收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻，控制溶液pH值，獲得最佳親水-親脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類(lèi)雜質(zhì)，使蛔蟲(chóng)卵更易下沉。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質(zhì)層及緩沖液層，獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻，于計(jì)數(shù)框中靜置漂浮后鏡檢，即可測(cè)得水樣中蛔蟲(chóng)卵的數(shù)量。4試劑和材料除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑，實(shí)驗(yàn)用水為新制備的蒸餾水或去離4.1乙酸乙酯(C?H?O?)。4.2乙酸-乙酸鈉緩沖液：pH=4.5。稱(chēng)取15.0g三水合乙酸鈉(CH?COONa-3H?O),溶于約800ml實(shí)驗(yàn)用水中，加入3.6ml乙酸(CH?COOH)調(diào)節(jié)pH值至4.5,用實(shí)驗(yàn)用水定容至1000ml。此溶液保質(zhì)期為30d。4.3吐溫80溶液：φ(C??H?O?)=1%。移取1ml吐溫80(Tween80),用實(shí)驗(yàn)用水稀釋定容至1000ml,臨用現(xiàn)配。4.4飽和硝酸鈉(NaNO?)溶液。稱(chēng)取略多于實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度對(duì)應(yīng)溶解度的硝酸鈉(NaNO?),充分溶解于100g實(shí)驗(yàn)用水中，用濾紙濾去殘?jiān)R用現(xiàn)配。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見(jiàn)附錄A。5儀器和設(shè)備除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)A級(jí)玻璃量器。25.1顯微鏡：物鏡4x、10×倍，目鏡10×倍。5.2冰箱：0～4℃。5.3水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)：帶50ml螺口尖底離心管，離心力1000g以上。5.4漩渦混勻器。5.5篩網(wǎng)：60目，φ250μm。5.6不銹鋼開(kāi)口直壁容器：10L。5.7開(kāi)口直壁量筒：1000ml。5.9洗瓶。5.10螺口尖底離心管：50ml。5.11一次性巴氏滴管：3ml、10ml。5.12微量移液器：1000μl。5.13定量計(jì)數(shù)框：1ml(網(wǎng)格)、5ml(S型)定量計(jì)數(shù)框。6樣品按HJ/T91中對(duì)一般污染物采樣的要求，用10L以上容積的塑料桶采樣。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶，采集樣品量應(yīng)≥10L,常溫下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行過(guò)濾(7.1)和沉淀(7.2)。7分析步驟充分搖勻樣品，轉(zhuǎn)入不銹鋼開(kāi)口直壁容器(5.6)至10L刻度。如樣品中含有草梗、紙?jiān)容^大雜質(zhì)，需將樣品用篩網(wǎng)(5.5)過(guò)濾，并用吐溫80溶液(4.3)清洗篩網(wǎng)(5.5)及雜質(zhì)，洗液并入過(guò)濾后的10L樣品中。上述樣品(7.1)在15～25℃室溫下靜置過(guò)夜沉淀12～24h,用虹吸管(5.8)小心吸取并棄去上清液，避免擾動(dòng)，保留1L含沉淀物的樣品，轉(zhuǎn)入1000ml開(kāi)口直壁量筒(5.7),分別用50ml吐溫80溶液(4.3)徹底清洗不銹鋼開(kāi)口直壁容器3次，洗液并入開(kāi)口直壁量筒(5.7)。在15～25℃室溫下再次靜置過(guò)夜沉淀12～24h,用虹吸管(5.8)吸取并棄去上清液，避免擾動(dòng)，保留90～100ml含沉淀物7.3離心沉淀濃縮后的樣品(7.2)小心轉(zhuǎn)移至3個(gè)螺口尖底離心管(5.10),分別用15ml吐溫80溶液(4.3)徹底清洗開(kāi)口直壁量筒3次，洗液均勻并入3個(gè)螺口尖底離心管。以1000g的離心力(離心機(jī)轉(zhuǎn)速計(jì)算見(jiàn)附錄A)離心15min,用巴氏滴管(5.11)小心吸取并棄去上清液，少量留之，避免帶出沉淀。用少量吐溫80溶液(4.3)將3個(gè)離心管中的沉淀進(jìn)行懸浮，將沉淀量少的2個(gè)離心管中的懸浮液并入沉淀量最多的一個(gè)離心管中；分別用3～5ml吐溫80溶液徹底清洗被轉(zhuǎn)移懸浮液的2個(gè)離心管，3每支清洗3次，確保沒(méi)有沉淀被丟棄，洗液并入沉淀量最多的離心管。以1000g的離心力離心15min,用巴氏滴管(5.11)小心吸取并棄去上清液，少量留之，避免帶出沉淀。用與離心后沉淀(7.3)等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液(4.2)對(duì)沉淀進(jìn)行懸浮(即：離心后沉淀體積為2ml,加入2ml緩沖液)。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4ml。以確保用乙酸乙酯(4.1)加入2倍離心后沉淀(7.3)體積的乙酸乙酯(4.1),用渦旋混勻器(5.4)完全混合。以1000g的離心力離心15min,樣品被分為清晰的三層。所有的非脂肪物質(zhì)、重碎片，包括蛔蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)和原生加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液(4.4),對(duì)分離去除脂類(lèi)雜質(zhì)后的含卵底層沉淀進(jìn)行懸浮。該懸浮液可置于0～4℃冰箱(5.2)冷藏保存，備檢，于1周內(nèi)檢測(cè)完畢，檢測(cè)時(shí)需將其靜置至室溫。充分搖勻懸浮液，將其轉(zhuǎn)入定量計(jì)數(shù)框(5.13),靜置5min,在顯微鏡下計(jì)數(shù)，直至全部懸浮液鏡檢完成。分別用1ml飽和硝酸鈉溶液(4.4)充分洗滌鏡檢完的離心管3次，將洗液轉(zhuǎn)入定量計(jì)數(shù)框(5.13),按以上步驟鏡檢。所有檢測(cè)到的蛔蟲(chóng)卵全部計(jì)數(shù)。鏡檢時(shí)，需保持環(huán)境條件的穩(wěn)定，無(wú)震動(dòng)和風(fēng)擾，緩移計(jì)數(shù)框，自上而下“U”型逐列計(jì)數(shù)。卵鑒定方法見(jiàn)附錄B。取10L同批次實(shí)驗(yàn)用水，按以上采樣及分析步驟進(jìn)行全程序空白樣品的測(cè)定。統(tǒng)計(jì)全部計(jì)數(shù)的蛔蟲(chóng)卵數(shù)，按式(1)計(jì)算并報(bào)告10L水樣中蛔蟲(chóng)卵數(shù)：8.2結(jié)果表示6家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)實(shí)際樣品和低濃度(20個(gè)/10L)、中濃度(40個(gè)/10L)、高濃度(80個(gè)/10L)自4配樣品的蛔蟲(chóng)卵進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為6.5%～18.9%,10.1%～22.0%,12.8%~23.8%,8.9%～17.4%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.8%、5.5%、4.9%、4.8%;重復(fù)性限(個(gè)/10L)為244、3、7、11;再現(xiàn)性限(個(gè)/10L)為260、3、7、11。10質(zhì)量保證和質(zhì)量控制每批次樣品至少做1個(gè)全程序空白試驗(yàn)，并取10%的樣品進(jìn)行平行樣測(cè)定。全程序空白試驗(yàn)不得檢出蛔蟲(chóng)卵，平行樣間的相對(duì)偏差不得超過(guò)30%。11廢物處理實(shí)驗(yàn)中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理，含乙酸乙酯的廢棄液應(yīng)集中保管，委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。12注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)用過(guò)的器具均需進(jìn)行高溫滅活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。實(shí)驗(yàn)操作人員要注意自身防護(hù)，試驗(yàn)時(shí)要穿戴工作服、乳膠手套及口罩等，同時(shí)還要避免含蛔蟲(chóng)卵的樣品污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。5(資料性附錄)硝酸鈉水中溶解度、離心機(jī)離心力及轉(zhuǎn)速計(jì)算公式A.1硝酸鈉在水中的溶解度表A.1硝酸鈉水中溶解度溫度/℃0A.2離心力計(jì)算公式離心力按式(A.1)進(jìn)行計(jì)算。r——離心機(jī)半徑(離心管中心至離心機(jī)軸的距離),cm;A.3離心力轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)速公式離心機(jī)轉(zhuǎn)速按式(A.2)進(jìn)行換算。6(資料性附錄)蛔蟲(chóng)卵的鑒定B.1蛔蟲(chóng)卵的形態(tài)特征B.1.1受精蛔蟲(chóng)卵蟲(chóng)卵呈短橢圓形，大小為(45～75μm)x(35～50μm)。卵殼很厚，自外向內(nèi)分為三層：受精膜、殼質(zhì)層和蛔甙層，殼質(zhì)層較厚，另兩層極薄，在普通顯微鏡下難以分清。卵殼內(nèi)有一個(gè)大而圓未分裂的受精卵細(xì)胞，與卵殼間常見(jiàn)有新月形空隙。卵殼外有一層由蟲(chóng)體子宮分泌形成的蛋白質(zhì)膜，其表面凹凸不平呈波浪狀。隨糞便排出的蟲(chóng)卵常被膽汁染成黃色或棕褐色。B.1.2未受精蛔蟲(chóng)卵蟲(chóng)卵呈長(zhǎng)橢圓形或不規(guī)則形，大小為(88～94μm)×(39～44μm),卵殼與蛋白質(zhì)膜均較受精蛔蟲(chóng)卵薄，淡黃色，無(wú)蛔甙層，卵殼內(nèi)含有許多大小不一的屈光顆粒。B.1.3感染期蛔蟲(chóng)卵卵內(nèi)含有一條卷曲的幼蟲(chóng)。B.1.4蛋白質(zhì)膜脫落的蛔蟲(chóng)卵若蛔蟲(chóng)卵的蛋白質(zhì)膜脫落，卵殼則呈無(wú)色透明，應(yīng)注意與其他線(xiàn)蟲(chóng)卵的鑒別。B.2蛔蟲(chóng)卵參考圖片圖B.1蛔蟲(chóng)卵模式圖7B.2.2發(fā)育各階段的蛔蟲(chóng)卵發(fā)育各階段的蛔蟲(chóng)卵8(資料性附錄)蛔蟲(chóng)卵配制樣品的制備豬蛔蟲(chóng)(Ascarissuum)活成蟲(chóng)采集自屠宰場(chǎng)，用蒸餾水洗滌干凈后，放置于含4%甲醛溶液內(nèi)，0~4℃保存?zhèn)溆?，可長(zhǎng)期保存。制備蛔蟲(chóng)卵備用液時(shí)，選取2～3條雌性蛔蟲(chóng)，用75%乙醇消毒過(guò)的解剖刀，劃開(kāi)蟲(chóng)體，每條蛔蟲(chóng)一對(duì)子宮選取靠近陰門(mén)的一段(2～3mm),解剖后，將含蛔蟲(chóng)卵的內(nèi)容物及組織碎片放入50ml離心管中，加入數(shù)顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水，混勻后于渦旋混勻器振蕩3～5min,用260目網(wǎng)過(guò)