基因工程及分子標(biāo)記育種

第三節(jié)基因工程及分子標(biāo)記育種學(xué)習(xí)要點(diǎn)：基因工程的含義、原理和方法基因工程在育種上的應(yīng)用分子標(biāo)記及其在育種上的應(yīng)用1基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024一、基因工程的基本概念原理和方法（一）基因工程的含義將具有遺傳信息的DNA片段，在離體條件下，用工具酶加以剪切、組合和拼接，再將人工重組的基因引入適當(dāng)?shù)氖荏w中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。2基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20241、DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（1）A、T、G、C。（2）DNA合成以5’-3’方向發(fā)生，半保留復(fù)制。（3）DNA的變性、復(fù)性、雜交。2、RNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（1）堿基：A、U、G、C。（2）細(xì)胞中含有3種RNA：tRNA、rRNA、mRNA。（二）基因工程的分子生物學(xué)基礎(chǔ)3基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20243、真核基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)的結(jié)構(gòu)與類型（1）啟動(dòng)子（promoter）基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的一段DNA序列，啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子成分主要由帽子位點(diǎn)、TATA盒（轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游TATAAATA）、CAAT盒（轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游GGTCAATCT）、GC盒（轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游CCGCCC）等組成。啟動(dòng)子的分類：組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子4基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（2）內(nèi)含子和外顯子

mRNA的剪接（splicing）現(xiàn)象：轉(zhuǎn)錄形成的mRNA前體（pre-mRNA）在作為蛋白質(zhì)的合成模板之前，非編碼序列會(huì)被刪除而成為成熟RNA。將基因中對(duì)應(yīng)于成熟mRNA中尚存部分的DNA序列稱為外顯子（exon），對(duì)應(yīng)于被切除的部分稱為內(nèi)含子（intron）。5基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（3）終止子（terminator）轉(zhuǎn)錄終止子：基因編碼區(qū)下游的可被RNA聚合酶識(shí)別和停止合成RNA的一段DNA序列。（4）增強(qiáng)子（enhancer）許多真核生物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄可被遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)千個(gè)堿基調(diào)控元件所增強(qiáng)，這一調(diào)控元件稱為增強(qiáng)子。（5）沉默子（silencer）在基因內(nèi)能抑制基因表達(dá)的DNA序列稱為沉默子，又稱為減弱子或抑制子。6基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20244、基因的不同區(qū)域及其作用（1）基因的功能結(jié)構(gòu)和分區(qū)①5’上游區(qū)②5’非翻譯區(qū)③編碼區(qū)④3’非翻譯區(qū)7基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20245、基因的表達(dá)與調(diào)控（1）基因的表達(dá)中心法則：轉(zhuǎn)錄：在基因表達(dá)過程中，DNA分子通過指導(dǎo)合成一條互補(bǔ)的RNA鏈，從而拷貝了自身的信息，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）.翻譯：由RNA指導(dǎo)合成多肽，其產(chǎn)物的氨基酸序列由RNA的堿基序列決定，這個(gè)過程稱為翻譯。8基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（三）基因工程基本技術(shù)1、核酸分離（1）DNA的分離：CTAB法提取植物基因組DNA（2）RNA的分離（3）DNA及RNA含量的測(cè)定、純度和質(zhì)量的評(píng)定理想的A260/A280應(yīng)為1.8，若樣品中有蛋白質(zhì)或多酚類物質(zhì)污染時(shí)，則明顯低于1.8；采用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合Southern雜交等方法可檢驗(yàn)基因組DNA質(zhì)量。9基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024測(cè)定RNA于260nm，280nm和230nm處的吸光值。理想的A260/A230應(yīng)大于為2.01000bp-500bp--28S-18S-5S改良的CTAB法提取的野百合基因組DNA芥菜RNA10基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20242.分子雜交分子雜交包括核酸分子雜交和蛋白質(zhì)雜交。核酸分子雜交分為Southern和Northern雜交。Southern雜交是指特異性探針結(jié)合的是基因組DNA；而Northern雜交特異性結(jié)合的是RNA分子。蛋白質(zhì)分子雜交稱為Western雜交。利用抗體抗原的特異性結(jié)合來檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子相互作用。11基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20243.PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（1）PCR的基本原理及影響因素（2）RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR）以RNA為起始模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）作用下，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲取目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)的方法。12基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（四）基因工程基本步驟與方法1.基因克隆策略（1）基因克隆第一：獲得DNA片段；第二：將DNA片段連接到載體上；第三：將包含外源DNA片段的載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞；宿主大多是大腸桿菌。第四：重組體的篩選。

13基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024基于基因功能的克隆法①根據(jù)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)；②根據(jù)基因的表型突變互補(bǔ)功能；基于遺傳圖譜的克隆方法基于差異表達(dá)的克隆方法①差示技術(shù)；②代表性差異分析；③競(jìng)爭(zhēng)雜交；④抑制性差減雜交；⑤交互式差異RNA技術(shù)2.基因分離14基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（4）DNA插入的克隆方法（5）縮減雜交法（6）基于隨機(jī)cDNA測(cè)序的克隆法（7）PCR擴(kuò)增法（8）同源序列法3.重組體DNA分子的構(gòu)建4.重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化：宿主細(xì)胞直接吸收外源質(zhì)粒DNA分子，并獲得某些新遺傳性狀的過程。15基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（1）插入失活（2）核酸雜交法原位雜交和分子雜交（3）免疫學(xué)篩選5.重組體分子的篩選16基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（五）遺傳轉(zhuǎn)化植物基因工程載體按用途可分為克隆載體、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化載體三類。17基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（六）基因工程在園藝植物遺傳改良中的應(yīng)用1.基因工程在育種中的應(yīng)用（1）改良品質(zhì)（2）提高抗病蟲能力（3）改善抗逆性（4）提高光合作用和固氮效率（5）創(chuàng)建雄性不育材料（6）延緩果實(shí)成熟（7）選育抗除草劑品種（8）改變花色、花形、花香18基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20242.存在的問題及展望（1）轉(zhuǎn)基因植物的安全性評(píng)價(jià)和環(huán)境釋放問題（2）轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題（3）知識(shí)產(chǎn)權(quán)與商品化發(fā)展問題（4）未來發(fā)展19基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024二、分子標(biāo)記技術(shù)1.分子標(biāo)記的概述（1）多態(tài)性與分子標(biāo)記每個(gè)DNA分子的堿基順序構(gòu)成了DNA分子的特異性，不同的DNA鏈編碼出完全不同的多肽鏈。

DNA多態(tài)性（polymorphism）是描述DNA分子變異大小的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，用以描述生物的遺傳變異。在遺傳育種研究中，每個(gè)與性狀或目的基因連鎖的多態(tài)位點(diǎn)稱為一個(gè)分子標(biāo)記。20基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024（2）分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)直接以DNA形式表現(xiàn)，穩(wěn)定。數(shù)量多，遍布整個(gè)基因組。多態(tài)性高。不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)。能鑒別純合基因型或雜合基因型。21基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20242.幾種DNA分子標(biāo)記

RFLPRAPDSSRAFLPISSR22基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20243.DNA分子標(biāo)記的種類依據(jù)對(duì)DNA多態(tài)性的檢驗(yàn)手段，DNA分子標(biāo)記可分為四大類：第一類：基于DNA-DNA雜交的DNA標(biāo)記。主要包括RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）和VNTR(variablenumberoftandemrepeat,可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù))標(biāo)記。23基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024第二類：基于PCR的DNA標(biāo)記。根據(jù)所用引物的特點(diǎn)，分為隨機(jī)引物PCR標(biāo)記和特異引物PCR標(biāo)記。前者包括RAPD（rapidamplifiedDNApolymorphism,隨即擴(kuò)增DNA多態(tài)性）標(biāo)記和ISSR（intersimplesequencerepeats,簡(jiǎn)單重復(fù)序列間標(biāo)記）標(biāo)記等。后者包括SSR標(biāo)記、SCAR（sequencecharacterizedamplifiedregion）標(biāo)記、STS（sequencetaggedsite）標(biāo)記等。24基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024第三類：基于PCR技術(shù)與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記?？煞譃閮深悾阂环N是先將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，再對(duì)其酶切片斷進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增的限制性片斷的長(zhǎng)度多態(tài)性，稱為AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）標(biāo)記。另一種是先對(duì)樣品DNA進(jìn)行專化性擴(kuò)增，再用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，檢測(cè)被擴(kuò)增片斷的多態(tài)性，稱為CAPS（cleavedamplifiedpolymorphicsequence）標(biāo)記。25基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024第四類：基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記，即SNP標(biāo)記。它是DNA序列中因單個(gè)堿基變異而引起的遺傳多樣性。目前SNP一般通過DNA芯片技術(shù)進(jìn)行分析。26基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20244.常用分子標(biāo)記的原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)（1）RAPD標(biāo)記①技術(shù)原理

10寡核苷酸為引物，對(duì)部分DNA序列進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，只有當(dāng)模板DNA鏈不太長(zhǎng)（≤2000bp）的區(qū)域內(nèi)存在2個(gè)與隨機(jī)引物反向互補(bǔ)（基本或完全互補(bǔ)）的序列時(shí)，這一段DNA才能被擴(kuò)增。

RAPD與常規(guī)PCR的不同之處：1.引物短，10寡核苷酸單鏈；2.一個(gè)引物，起兩個(gè)引物的作用；3.退火溫度較低（35-40℃），以利于多態(tài)性的檢出。27基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。②基本技術(shù)及影響因素PCR反應(yīng)程序：

Step194℃5minStep294℃30sStep336℃30sStep472℃1min30sStep5Gotostep240cyclesStep672℃7minStep74℃end28基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/20243000bp

M1234565000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpMg2+濃度對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響注：1～6分別為1.5、2.0、2.25、2.5、3.0、3.5(mmol/L)29基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024過高的dNTPs

濃度會(huì)同Taq

DNA聚合酶競(jìng)爭(zhēng)Mg2+，使Mg2+總量下降，抑制Taq

DNA聚合酶的活性，同時(shí)也會(huì)使錯(cuò)誤率大大增加，濃度太低會(huì)使PCR產(chǎn)物減少。100bp250bp500bp2000bp1000bp5000bp

M1234563000bpdNTPs濃度對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響注：1～6分別為0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.05(mmol/L)750bp30基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024TaqDNA聚合酶含量過高時(shí)會(huì)有小片段產(chǎn)生，呈現(xiàn)彌散狀態(tài)。TaqDNA聚合酶含量過低則導(dǎo)致擴(kuò)增條帶太弱。500bp750bp1000bp2000bp5000bp3000bpTaq酶用量對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響注：1～6分別為0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5(U)M12345631基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024DNA模板濃度低于一定范圍時(shí)分子的碰撞幾率降低，偶然性大，擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定；濃度太高又會(huì)造成模板DNA浪費(fèi)還會(huì)使非特異性增加。100bp250bp500bp1000bp2000bp3000bp

M1234565000bp750bpDNA模板用量對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響注：1～6分別為10、20、40、60、80、100(ng)32基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024引物濃度過低，無(wú)法與所有的模板DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不理想，引物濃度過高時(shí)，會(huì)促使引物錯(cuò)誤地引導(dǎo)非特異性產(chǎn)物的合成。

M123456250bp2000bp100bp500bp750bp1000bp5000bp3000bp引物用量對(duì)RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響注：1～6分別為5、7.5、10、12.5、15、20(pmol)33基因工程及分子標(biāo)記育種5/8/2024引物S263對(duì)28份觀賞南瓜種質(zhì)擴(kuò)增的RAPD帶型注：從左到右依次為Marke